摘要：微流控技術(shù)（Microfluidics）為粒子和細(xì)胞操控提供了新平臺(tái)?；诹Ｗ討T性遷移和微凹槽渦胞捕獲的粒子分選方法，成為一種重要的微流控粒子操控技術(shù)。目前，微凹槽容納的捕獲粒子數(shù)量不高，制約了該方法的效率。為提高微凹槽粒子容量，對(duì)圓形微凹槽進(jìn)行結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，并利用高速顯微成像技術(shù)和數(shù)值模擬，研究了不同圓形微凹槽的粒子容納能力。研究發(fā)現(xiàn)，相同入口雷諾數(shù)（Re = 37~555）下，帶底腔的圓形微凹槽相較于普通圓形微凹槽容納的粒子數(shù)量提升了 45%；當(dāng) Re = 444 時(shí)，帶底腔的直徑 500 μm 的圓凹槽比直徑 600 μm 的圓凹槽的粒子容量提高了 54.7%，原因是前者凹槽內(nèi)內(nèi)粒子運(yùn)動(dòng)軌道與流線更加吻合，粒子軌道面積與凹槽面積占比達(dá)到了97%；從側(cè)通道收集到的 20 μm 粒子的最大富集濃度為初始懸浮液的 126.7 倍。研究結(jié)果對(duì)微凹槽結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)、提高粒子分選性能有重要指導(dǎo)意義。

在細(xì)胞分析檢測(cè)中，從復(fù)雜的細(xì)胞溶液中對(duì)目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行分選和富集是至關(guān)重要的樣本處理步驟。傳統(tǒng)方法，如離心[2]和熒光激活細(xì)胞分選，是實(shí)驗(yàn)室和醫(yī)院廣泛使用的技術(shù)之一，但需要龐大、昂貴的儀器，且存在目標(biāo)細(xì)胞污染和丟失。

微流控技術(shù)（Microfluidics）是在微米級(jí)通道中操控微小體積流體（10-9~ 10-12L）或樣本的多學(xué)科交叉的新興研究領(lǐng)域。由于微通道尺寸與細(xì)胞尺寸相當(dāng)，微流控技術(shù)在細(xì)胞分選操控方面的能力凸顯出來，具備高效率、高純度和低成本等優(yōu)勢(shì)，成為粒子和細(xì)胞分選的新平臺(tái)。微流控粒子分選可分為生物方法和物理方法。前者需要對(duì)通道壁面進(jìn)行生物化學(xué)修飾，后者基于細(xì)胞物理性質(zhì)差異（尺寸、密度、表面電荷量和變形性等），可再分為主動(dòng)式和被動(dòng)式兩種。主動(dòng)式需要外加力場(chǎng)（磁、電、光、聲等），被動(dòng)式僅通過設(shè)計(jì)巧妙的通道結(jié)構(gòu)，利用微通道中流體流動(dòng)來操控粒子運(yùn)動(dòng)。其中，慣性微流控技術(shù)（Inertial Microfluidics）僅利用微通道中粒子和流體的慣性效應(yīng)實(shí)現(xiàn)分選，成為了被動(dòng)式物理方法的代表。慣性升力驅(qū)動(dòng)顆粒發(fā)生側(cè)向遷移，通過改變通道形狀和入口流速等調(diào)控顆粒的運(yùn)動(dòng)，實(shí)現(xiàn)顆粒的遷移聚焦，微通道幾何形狀包括：彎曲通道、螺旋通道和蛇形通道等。

基于微凹槽渦的粒子分選方法充分利用直通道中粒子慣性遷移和微凹槽內(nèi)的渦胞流動(dòng)，可以將含量極低的（10-9）循環(huán)腫瘤細(xì)胞（Circulating Tumor Cells, CTCs，12~30 μm）從全血細(xì)胞中分選出來，且可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)粒子的富集，具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、并行化、效率高、細(xì)胞損傷小等優(yōu)點(diǎn)，成為了一種重要的慣性微流控方法，有望成為實(shí)現(xiàn)癌癥“液體活檢（Liquid Biopsy）”的關(guān)鍵技術(shù)。

自 Di Carlo 團(tuán)隊(duì)首次報(bào)道了基于微凹槽渦的粒子分選方法以來，為了提高粒子分選效率，許多研究者對(duì)矩形凹槽尺寸、長(zhǎng)寬比和入口流速等因素進(jìn)行了優(yōu)化研究。Zhou 等對(duì)矩形凹槽尺寸、粒子直徑及濃度等因素進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)和流場(chǎng)仿真，發(fā)現(xiàn)隨入口雷諾數(shù)（Reynolds number，Re）增大（130-330），單個(gè) 400×400 μm2 凹槽內(nèi)粒子數(shù)量先增多后減少的現(xiàn)象（最大值<40 個(gè)）。Haddadi 等對(duì)凹槽尺寸和工況進(jìn)行了優(yōu)化，也發(fā)現(xiàn)凹槽會(huì)達(dá)到飽和狀態(tài)，制約了該方法的分選效率，并改進(jìn)了凹槽排布方式。此外，Wang 等在矩形凹槽側(cè)面增加了排液通道，實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)粒子的連續(xù)排出與收集。Volpe 等設(shè)計(jì)了一種立體式芯片結(jié)構(gòu)，側(cè)通道排出的粒子直接流入下面的收集池。然而，多個(gè)凹槽并行時(shí)，需要設(shè)計(jì)更多的出口通道。

目前研究，多關(guān)注該方法的技術(shù)應(yīng)用，對(duì)微凹槽渦內(nèi)的粒子軌道運(yùn)動(dòng)行為認(rèn)識(shí)尚不深入，需要將其中的微凹槽容納機(jī)理獨(dú)立出來研究。當(dāng)凹槽容量飽和時(shí)，捕獲的目標(biāo)粒子發(fā)生逸出，從而限制了分選性能，阻礙了其臨床應(yīng)用。提高凹槽粒子容量，既可以提高分選效率，又提高了目標(biāo)粒子富集濃度，有利于進(jìn)一步的細(xì)胞檢測(cè)。

作者前期研究發(fā)現(xiàn)矩形凹槽結(jié)構(gòu)與粒子運(yùn)動(dòng)軌道并不吻合，并首次采用圓形微凹槽進(jìn)行粒子分選實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)圓形凹槽結(jié)構(gòu)與粒子軌道更加吻合，粒子數(shù)量和濃度分別提高了 3~5 倍和 2~4 倍。本文進(jìn)一步對(duì)圓形凹槽進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化探索，設(shè)計(jì)了8 種圓形凹槽結(jié)構(gòu)，并開展了顯微高速攝影實(shí)驗(yàn)和數(shù)值仿真，對(duì)比研究了不同凹槽幾何因素和 Re 對(duì)粒子容量影響，并結(jié)合粒子運(yùn)動(dòng)軌道和流場(chǎng)仿真初步探討了圓凹槽粒子容納機(jī)理。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 微流控芯片

微流控芯片由主通道和三個(gè)不同形狀的圓凹槽（Cavity I、II、III）組成，如圖 1 所示。主通道寬度為 W=80 μm，深度為 H=100 μm。凹槽入口寬度均為 Lc=400 μm，凹槽 I、II 的圓形區(qū)域直徑為 D=500μm，而凹槽 III 為 D=600 μm，以研究圓凹槽尺寸對(duì)粒子容量的影響。凹槽 II、III 的下方設(shè)計(jì)了 400′200μm2 底腔，以研究底腔對(duì)容量的影響。凹槽間距為2000 μm，側(cè)方連接出口通道，用于釋放捕獲的目標(biāo)粒子。制作微流控芯片的材料為聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxanes，PDMS），模具由標(biāo)準(zhǔn)光刻蝕技術(shù)制作。前人研究中為了使粒子慣性聚焦到直通道兩側(cè)平衡位置，寬度一般設(shè)置為 60-80μm。由于尺寸較小的微凹槽的空間有限，容納的目標(biāo)粒子少，而較大的凹槽形成渦流的臨界 Re較高，導(dǎo)致切應(yīng)力升高，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷，故實(shí)驗(yàn)中的凹槽直徑為 500 μm 和 600 μm 兩種。

1.2 實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)

實(shí)驗(yàn)中，在去離子水中加入聚苯乙烯小球模擬真實(shí)稀釋的血液，同時(shí)加入表面活性劑 Tween20以防止粒子發(fā)生團(tuán)聚或粘附于通道壁面。目前研究中常采用粒子代替真實(shí) CTCs 細(xì)胞，開展機(jī)理研究，為細(xì)胞分選應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。實(shí)驗(yàn)過程中，首先關(guān)閉粒子釋放出口，然后用注射泵將注射器中的混合液從主通道入口 Inlet注入，流量 Q 為 0.8~2.2 mL/min。粒子經(jīng)過凹槽捕獲后，剩余混合液從主通道出口 Outlet 流出。當(dāng)凹槽容納的目標(biāo)粒子數(shù)量飽和后，并打開出口通道，收集得到高濃度的目標(biāo)粒子溶液。

高速顯微成像系統(tǒng)由倒置顯微鏡、高速攝像機(jī)和數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)組成，如圖 2 所示。對(duì)凹槽內(nèi)捕獲的目標(biāo)粒子運(yùn)動(dòng)進(jìn)行觀測(cè)和記錄，視頻分辨率為832×600 像素，幀率為 10KHz。采用 Matlab和 ImageJ軟件對(duì)粒子圖像進(jìn)行處理，得到粒子運(yùn)動(dòng)軌跡和疊加圖像等。實(shí)驗(yàn)在 25 ℃的室溫下進(jìn)行。

1.3 數(shù)值仿真

利用 ANSYS-Fluent（V19.0）進(jìn)行微凹槽流場(chǎng)特性數(shù)值模擬，主要過程包括：模型建立、網(wǎng)格劃分、網(wǎng)格優(yōu)化及獨(dú)立性驗(yàn)證、邊界及條件設(shè)置、運(yùn)算求解和結(jié)果后處理分析等。首先，通過建模軟件SolidWorks 建立微通道流域三維模型，如圖 3（a）所示，包括 4 組凹槽結(jié)構(gòu)。由于粒子分選捕獲過程中側(cè)通道出口是關(guān)閉的，故建模時(shí)簡(jiǎn)化掉了側(cè)通道。然后，通過 Hypermesh 軟件進(jìn)行模型的網(wǎng)格劃分，采用非結(jié)構(gòu)化四面體網(wǎng)格。最后，采用去離子水作為工作流體，設(shè)置流量入口（Q）和壓力出口大氣壓（Patm）條件，壁面均采用無滑移邊界條件，選擇層流模型，采用SIMPLE 算法來求解速度場(chǎng)和壓力場(chǎng)耦合的問題，求解控制方程，收斂精度為 10-5。為提高計(jì)算準(zhǔn)確性，進(jìn)行了網(wǎng)格優(yōu)化和獨(dú)立性驗(yàn)證。提取了不同網(wǎng)格數(shù)量模型直徑 500 μm 圓形凹槽中心處 y 方向的速度分布，如圖 3（b）所示。由圖可知，當(dāng)網(wǎng)格量大于 72642 時(shí)，速度基本不再變化，計(jì)算結(jié)果與網(wǎng)格數(shù)量無關(guān)。

1.4 微凹槽粒子容納機(jī)理

微流控系統(tǒng)中流體一般處于層流或斯托克斯流（Stokes flow）狀態(tài)（Re→0），但高通量時(shí)，中部范圍流動(dòng)（Intermediate flow）狀態(tài)（~1<Re <100）甚至 re="">100 的流動(dòng)均出現(xiàn)在微通道內(nèi)，此時(shí)流體慣性作用不可忽略，Re、界面張力和粘度等參數(shù)對(duì)流場(chǎng)和粒子運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生重要影響。粒子流動(dòng)可通過微通道雷諾數(shù) Re 和粒子雷諾數(shù) Rep 表征：

剛性顆粒在受限直通道泊肅葉流中運(yùn)動(dòng)受到四個(gè)橫向升力作用：由于滑移-自旋效應(yīng)的馬格努斯升力、由于滑移-剪切效應(yīng)的薩夫曼升力、壁面誘導(dǎo)升力和剪切梯度升力。其中，馬格努斯升力和薩夫曼升力通常非常小，可以忽略不計(jì)。剪切梯度升力（FLS）和壁面誘導(dǎo)升力（FLW）是顆粒橫向遷移的主要影響因素，前者引導(dǎo)粒子向通道壁面移動(dòng)，后者排斥粒子向通道中心線移動(dòng)。

凹槽粒子分選過程分三個(gè)步驟，如圖 4 所示：（i）直通道粒子慣性聚焦：在 FLS 和 FLW 的作用下，大小粒子發(fā)生慣性遷移，聚焦到通道側(cè)壁面附近的平衡位置；（ii）凹槽入口區(qū)域粒子橫向遷移：FLW降低，F(xiàn)LS 主導(dǎo)粒子向凹槽底部遷移，遷移速度與粒徑成正比；（iii）微凹槽渦內(nèi)粒子軌道循環(huán)運(yùn)動(dòng)：被捕獲的目標(biāo)粒子在凹槽內(nèi)隨渦胞做周期性軌道循環(huán)運(yùn)動(dòng)，對(duì)凹槽粒子容量有重要影響。

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