3.   基于液滴的共培養(yǎng)技術(shù)研究微生物相互作用

微生物相互作用是微生物群落功能和動(dòng)態(tài)的主要驅(qū)動(dòng)因素，利用液滴微流控技術(shù)在液滴中對(duì)微生物進(jìn)行共培養(yǎng)，非常適用于高通量地研究微生物在各種環(huán)境下的相互作用。PARK等首先使用微液滴進(jìn)行細(xì)菌共培養(yǎng)，當(dāng)兩個(gè)交互共生的菌株被封裝進(jìn)同一個(gè)液滴時(shí)，它們都可以生存和繁衍。TAN等在液滴中共培養(yǎng)糞便樣本中的亞群落，分離出22個(gè)有較強(qiáng)的細(xì)菌共生長(zhǎng)的液滴，并進(jìn)行基因組測(cè)序以研究細(xì)菌亞群落的特征。這一技術(shù)也可用于研究微生物的跨界相互作用。JAROSZ等用液滴微流控技術(shù)共培養(yǎng)酵母和細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)少數(shù)細(xì)菌可誘導(dǎo)酵母的代謝轉(zhuǎn)化，這一策略可用于微生物次級(jí)代謝物的篩選。LAM等利用液滴微流控共培養(yǎng)技術(shù)研究肺炎球菌間的基因水平轉(zhuǎn)移，發(fā)現(xiàn)在短期的細(xì)胞間相互作用后，發(fā)生了多次重合轉(zhuǎn)移和大塊或大片的轉(zhuǎn)移。HSU等將兩個(gè)或三個(gè)菌種隨機(jī)混合封裝到液滴中進(jìn)行多個(gè)亞群落的平行培養(yǎng)，結(jié)合熒光顯微鏡和計(jì)算機(jī)快速的測(cè)定上千個(gè)液滴中每個(gè)菌種的絕對(duì)豐度，成功構(gòu)建出不同環(huán)境中微生物群落復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)。

基于液滴的高通量共培養(yǎng)和分離技術(shù)可用于篩選具有抗菌活性的益生菌。利用這一策略，SALESKI等成功從大腸桿菌突變文庫(kù)中分離出一株高異丁醇產(chǎn)生能力的菌株。在另一個(gè)報(bào)道中，研究人員將金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）與西伯利亞熊的口腔微生物組置于微流控液滴中共培養(yǎng)，成功篩選出一株有抗金黃色葡萄球菌活性的芽孢桿菌。

4.   抗生素敏感性試驗(yàn)

基于微流控的細(xì)菌培養(yǎng)方法是進(jìn)行自動(dòng)且快速抗生素敏感性試驗(yàn)的一個(gè)很有前景的工具。近年來(lái)，多種基于微流控的方法被開(kāi)發(fā)出來(lái)用于抗生素敏感性試驗(yàn)，比如微室、微通道和基于液滴的方法，其中，基于液滴的方法由于其能產(chǎn)生大規(guī)模的超小體積液滴用于高通量和高敏感性的檢測(cè)而被廣泛使用。

BOEDICKER等最早開(kāi)發(fā)了用于抗生素敏感性試驗(yàn)的液滴微流控平臺(tái)，可在7 h內(nèi)對(duì)多種藥物在多個(gè)不同的濃度進(jìn)行試驗(yàn)。KAUSHIK等開(kāi)發(fā)了dropFAST平臺(tái)，將抗生素和活細(xì)胞指示劑刃天青以及單一細(xì)菌封裝在皮升級(jí)的液滴中，培養(yǎng)1 h后，測(cè)定液滴中的熒光強(qiáng)度用于對(duì)活細(xì)菌進(jìn)行定量并評(píng)估抗生素敏感性。為了進(jìn)一步增大測(cè)試通量，POSTEK等開(kāi)發(fā)了一種微流控平臺(tái)，可以產(chǎn)生一系列乳狀液，每份乳狀液都含有密集的液滴，并通過(guò)第三不互溶相彼此分離。單個(gè)細(xì)菌被封裝在液滴中，每份乳狀液包含不同濃度的抗生素和相同濃度的細(xì)菌。這一系統(tǒng)使得在單次實(shí)驗(yàn)中可對(duì)單個(gè)細(xì)胞的抗生素敏感性試驗(yàn)在一系列抗生素濃度上進(jìn)行上百次試驗(yàn)。KANG等設(shè)計(jì)了一種由4個(gè)集成微液滴陣列組成的平臺(tái)，每個(gè)微滴陣列承載8000多個(gè)對(duì)接點(diǎn)，可同時(shí)篩選四種抗生素/病原體組合，在15~30 min內(nèi)進(jìn)行抗生素敏感性評(píng)估。

液滴微流控技術(shù)也能用于評(píng)估抗病毒藥物。MASHAGHI等設(shè)計(jì)了一種用于篩選候選化合物的病毒融合試驗(yàn)。采用定量熒光探針，在亞秒時(shí)間分辨率上測(cè)定了甲型流感病毒與微滴中靶脂質(zhì)體的融合動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。從候選藥物在病毒融合動(dòng)力學(xué)方面的特征可獲取藥物作用機(jī)制的相關(guān)信息。此外，為了確定潛伏期逆轉(zhuǎn)劑對(duì)HIV再激活的影響，研究者開(kāi)發(fā)了一種用于高通量封裝HIV感染細(xì)胞和直接鑒定HIV感染細(xì)胞的微流控裝置。利用其對(duì)從接受抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的患者獲得的單個(gè)CD4+ T細(xì)胞進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，潛伏期逆轉(zhuǎn)劑在某些情況下增強(qiáng)了活性細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄，而在其他情況下增加了轉(zhuǎn)錄活性細(xì)胞的數(shù)量。

5.   工程菌株與微生物資源開(kāi)發(fā)

液滴微流體為菌株改良、代謝產(chǎn)物篩選和生物合成基因簇發(fā)現(xiàn)提供了一個(gè)有效的平臺(tái)。JIAN等設(shè)計(jì)了一種微生物微滴培養(yǎng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)在多達(dá)200個(gè)液滴中自動(dòng)執(zhí)行微生物培養(yǎng)、生長(zhǎng)監(jiān)測(cè)和適應(yīng)性進(jìn)化，在該系統(tǒng)中對(duì)甲醇必需型大腸桿菌菌株進(jìn)行了為期18 d的適應(yīng)性進(jìn)化，獲得了兩株生長(zhǎng)速度比親本菌株更快的菌株。將可能產(chǎn)生氨基酸的菌株和報(bào)告菌株封裝在液滴中，可以識(shí)別自然分泌氨基酸的菌株，研究人員用該方法分離出了三株突變的乳酸乳球菌菌株，與野生型相比，氨基酸分泌增加了5~10倍。MAHLER等將報(bào)告菌株注射到所有液滴中，對(duì)來(lái)自自然微生物群落的抗生素產(chǎn)生株進(jìn)行了高通量篩選。

將宏基因組文庫(kù)構(gòu)建與液滴篩選相結(jié)合，有助于從微生物中發(fā)現(xiàn)生物合成基因簇。MA等建立了生活自來(lái)水樣品中大腸桿菌的宏基因組文庫(kù)，結(jié)合液滴微流控技術(shù)，他們鑒定到了一種催化效率高、進(jìn)化起源與其他脂解酶不同的新型酯酶。相似的手段也被用于從黏液相關(guān)的腸道微生物群中篩選宿主聚糖降解酶類，結(jié)果揭示了腸道細(xì)菌尤其是致病菌代謝人類聚糖的新途徑。XU等開(kāi)發(fā)了一種微流控自動(dòng)質(zhì)粒文庫(kù)富集系統(tǒng)用于對(duì)微生物的生物合成基因簇進(jìn)行分離和測(cè)序，該系統(tǒng)已成功應(yīng)用于從南極土壤宏基因組中分離并測(cè)定了Ⅰ型聚酮合酶基因簇序列。

液滴微流控技術(shù)也可用于定向進(jìn)化，定向進(jìn)化是蛋白質(zhì)工程中一種常用的方法，通過(guò)模擬自然選擇過(guò)程，引導(dǎo)蛋白質(zhì)或核酸實(shí)現(xiàn)所需功能。液滴微流體技術(shù)能進(jìn)行高通量分選的優(yōu)勢(shì)使其成為進(jìn)行定向進(jìn)化的理想平臺(tái)。VALLEJO等建立了一種熒光激活的液滴分選裝置，以進(jìn)化用于合成和修飾人工遺傳聚合物的酶。ZURKE等通過(guò)在微液滴中進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)，將酶活性測(cè)定的靈敏度和DNA回收率提高了一個(gè)數(shù)量級(jí)，使蛋白質(zhì)工程更易于識(shí)別或進(jìn)化出可應(yīng)用于合成和化學(xué)生物學(xué)的新酶。

6.   總結(jié)與展望

液滴微流控作為一個(gè)高通量高分辨率且高度集成化的新興技術(shù)平臺(tái)，可與多種檢測(cè)技術(shù)結(jié)合，在從微生物培養(yǎng)到微生物組學(xué)研究再到微生物資源開(kāi)發(fā)利用等方面扮演重要的角色。由于其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，液滴微流體技術(shù)有望成為微生物學(xué)家探索微生物世界的基礎(chǔ)技術(shù)工具。目前液滴微流控技術(shù)仍面臨著一些挑戰(zhàn)。首先，液滴微流控技術(shù)用于微生物研究仍有一些技術(shù)局限需要突破，如液滴中物質(zhì)交換能力有限、難以解決不同微生物種類的需氧量差異等問(wèn)題。此外，還缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的設(shè)備和操作流程，只有少量的液滴微流控設(shè)備用于特定需求的分析，大多數(shù)利用液滴微流控技術(shù)的研究仍需要研究人員自己設(shè)計(jì)并制作微流控設(shè)備，設(shè)備的制作和操控均存在很大挑戰(zhàn)。因此，未來(lái)需要對(duì)液滴微流控系統(tǒng)進(jìn)行自動(dòng)化和簡(jiǎn)約化改進(jìn)，為其在微生物研究中的應(yīng)用提供全方位、標(biāo)準(zhǔn)化的設(shè)備和操作流程，繼續(xù)創(chuàng)新和改進(jìn)下游的分析手段。相信隨著微流控技術(shù)的發(fā)展，在多學(xué)科的高度配合下，液滴微流控技術(shù)進(jìn)一步發(fā)展和成熟直至走進(jìn)每一個(gè)微生物實(shí)驗(yàn)室，服務(wù)微生物學(xué)科的研究發(fā)展將成為現(xiàn)實(shí)。

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