2 微流控芯片系統(tǒng)及數(shù)值模型模擬在白細胞流變學行為研究進展

2.1 基于微流控芯片系統(tǒng)的白細胞流動變形特性研究

白細胞在隨血液流動過程中，收到慣性升力和細胞-血管壁相互作用的影響，會發(fā)生邊集并貼附在血管內(nèi)壁進行滾動。白細胞的滾動行為受兩種力的支配，即血流的剪切應力和白細胞膜-血管內(nèi)皮間的粘附作用力。炎癥的最初跡象之一是白細胞粘附在靜脈血管壁上。這種粘附始于粒細胞沿靜脈血管壁的滾動運動，其速度遠遠慢于紅細胞在相同血管中的流動速度。在滾動與粘附的過程中，白細胞能夠識別趨化因子并接收炎癥信號。隨著炎癥的發(fā)展,越來越多的滾動白細胞停滯下來，其中一部分白細胞外滲出血管至炎癥區(qū)域所在的部位。

在輸血前，需要對提供的血液進行白細胞濾過，因為白細胞在輸注到患者身上時會被其自身的白細胞抵御，引發(fā)各種不良反應。白細胞在血液中邊集的這一動態(tài)特性可以用于白細胞的濾過。Xia 等人就利用受控增量過濾（Controlled incremental filtration，CIF）技術設計了一種微流控芯片系統(tǒng)，可以高效過濾分離白細胞。在該裝置中，有一個主通道和位于兩側平行的側通道，利用主通道與側通道之間規(guī)則分布的間隙過濾分離白細胞。他們經(jīng)實驗證實，利用該微流控裝置可以實現(xiàn)白細胞的高效快速過濾分離，進而將血液中白細胞濃度降低至原來的千分之一。

白細胞外滲遷移通常由趨化因子介導，通過感知趨化因子濃度遷移到特定位置（如損傷或感染組織）來完成免疫功能。白細胞遷移失敗或遷移到不當位置會對人體產(chǎn)生傷害。因此，利用微 流控裝置對白細胞外滲遷移影響機制非常重要。Cheng 等人設計了一種基于水凝膠的微流控裝置來研究白細胞的遷移。該裝置采用三通道設計，在一個外通道中設置恒定的趨化因子濃度，在另一個外通道中設置空白緩沖液。這樣的設計可以避免力學刺激影響化學刺激，進而防止剪切應力影響趨化因子梯度分布。通過該裝置，他們成功檢測到了白細胞的趨化反應。炎癥與許多疾?。ㄈ鐒用}粥樣硬化）相關，最初的炎癥反應包括白細胞沿著毛細血管后靜脈粘附到感染部位的血管內(nèi)皮并進行滾動，這一粘附滾動過程由多個不連續(xù)步驟組成，受多種因素包括趨化因子影響。因此，研究各種因素對白細胞粘附滾動的影響具有重要意義。Schaff 等人設計了一種平行板幾何結構的微流控裝置，可用于直接觀察白細胞在微通道中的粘附滾動情況。利用該裝置，他們研究分析了不同趨化因子濃度下白細胞的粘附滾動和停滯情況，認為從血液中轉移白細胞受趨化因子與整合素等因素影響。

與正常生理條件下的白細胞運動行為相比，病理條件下的白細胞在邊集、滾動、外滲和遷移等運動行為上有不同的表現(xiàn)。因此，有必要研究病理條件下白細胞的運動行為以及其受藥物作用的影響。Fay 等人設計了兩個獨立的體外微流控芯片系統(tǒng)，分別模擬毛細血管和靜脈，并研究了兩種白細胞邊集與粘附的情況。利用仿生毛細血管微流控裝置，他們通過測量白細胞通過一定距離所需的時間來評估白細胞的邊集程度；利用仿生靜脈微流控裝置，他們通過測量白細胞與通道壁的間距來評估白細胞的邊集情況。通過對比實驗，他們發(fā)現(xiàn)地塞米松等抗炎藥物可以抑制白細胞的邊集行為，這對揭示白細胞動態(tài)行為變化的影響機制具有重要意義。另外，Tsai 等人設計了一種微流控器件來模擬毛細血管后小靜脈和小動脈形成的分叉血管網(wǎng)絡，并在生理和病理血流下分析白細胞-內(nèi)皮細胞粘附行為對微血管堵塞及血栓形成的影響。他們發(fā)現(xiàn)，白細胞-內(nèi)皮細胞粘附及多細胞聚集等力學因素可以對包括血流速在內(nèi)的多種血流動力學指標帶來顯著影響。同時，他們還定量分析了羥基脲藥物對微血管堵塞的影響，發(fā)現(xiàn)該藥物可以降低微血管栓塞的幾率，從而為解釋該藥物的臨床療效提供了細胞水平的數(shù)據(jù)支持。

2.2 白細胞在微管道流動變形行為的數(shù)值模型模擬

白細胞是人體最主要的免疫細胞，擔任著免疫防御、免疫穩(wěn)定和免疫監(jiān)視的角色，研究其邊集、遷移及滲出等動力學行為對深入理解其免疫功能至關重要。數(shù)值模型模擬技術的應用可以幫助我們深入理解細胞水平上白細胞的運動行為，包括細胞流動變形行為、邊集及粘附等過程。

研究表明，白細胞的邊集行為受多種因素的影響，包括紅細胞壓積、局部血流速率和速度分布、以及紅細胞-紅細胞的聚集性能。顯然，通過微流控實驗研究分析這些影響因素對白細胞行為的影響有很大的挑戰(zhàn)。因此，研究人員開始利用數(shù)值模型模擬來深入探討相關的白細胞邊集/流動規(guī)律及影響機制。Fedosov 等人模擬了白細胞在不同紅細胞壓積下的邊集行為，發(fā)現(xiàn)紅細胞的高壓積有助于白細胞的邊集。他們認為，這是因為高壓積的紅細胞具有更大的聚集區(qū)域和更緊密的堆積性，將白細胞推向血管壁面的力則會更大，從而使得白細胞更容易邊集。Freund 等人用29個紅細胞和1個白細胞模擬了白細胞在微血管中的邊集行為，他們探究了血液流速對白細胞邊集的影響，發(fā)現(xiàn)白細胞邊集的位置與血管中的無細胞層（Cell-free layer, CFL）息息相關。

白細胞的邊集與遷移受到紅細胞壓積的影響，同時與血管中的無細胞層的流速息息相關。這些理論結果為仿生微納機器人的研發(fā)提供了新的思路。例如，Alapan 等人研發(fā)了一種磁性驅動的微納機器人，這種機器人模仿白細胞的邊集和遷移實現(xiàn)靶向遞藥。但這樣的仿白細胞微納機器人在血管內(nèi)的生物力學和生物流變學對受控的剪切應力的響應機制目前尚不清楚?；诖耍琎i 等人基于耗散粒子動力學方法構建了類似的仿白細胞微納機器人模型，以研究其在不同剪切應力水平下的動態(tài)性能（如圖 4）。他們的仿真結果表明，磁轉矩可以精準控制被磁化的微納機器人在血管內(nèi)的順流及逆流運動，且逆流速度隨著磁轉矩強度的增大而增大。此外，他們還發(fā)現(xiàn)流動的紅細胞會與逆流運動的微納機器人發(fā)生碰撞，進而阻礙其運動。這些模擬結果有助于理解單個微納機器人在血流中的爬行動力學行為，為促進仿生微納機器人在靶向和局部治療中的設計提供了一定的理論指導。

圖 4 仿生白細胞微型機器人在微管道中的流動變形的數(shù)值模型模擬

3 微流控芯片系統(tǒng)及數(shù)值模型模擬在干細胞流變學行為研究進展

3.1 基于微流控芯片系統(tǒng)的干細胞變形特性研究

用于治療的干細胞被注射入血液循環(huán)系統(tǒng)后將會有什么樣的經(jīng)歷和命運？了解干細胞在微血管內(nèi)的“冒險經(jīng)歷”對提高干細胞療法的療效有著重要的意義。干細胞直徑通常為 15-30 微米，這一數(shù)據(jù)顯然大于毛細血管直徑（3-10 微米），意味著進入微血管的干細胞易造成血管堵塞，直接導致細胞無法進入下一步的歸巢環(huán)節(jié)。因此，了解干細胞的變形性能對提高干細胞療法的療效至關重要。微流控細胞變形性檢測方法因其操作簡單、無需標記樣本、成本低、通量高的特點成為了單細胞力學表型分析的有力工具，在研究細胞變形過程中的生理狀態(tài)和病理變化方面表現(xiàn)出了巨大的潛力。目前，基于微流控技術的細胞力學表型測量方法主要有三種： 收 縮 變 形 流 式 細 胞 術 （ Constriction deformability cytometry，cDC）、流體剪切變形流式細胞術（Fluid shear deformability cytometry，sDC）和拉伸變形流式細胞術（Extensional flow deformability，xDC）。這三種典型微流控流式細胞術是在流場中分別利用壓力、剪力、拉力驅動目標細胞產(chǎn)生不同程度的變形，從而量化其變形能力。通過以上三種方法，可以直接觀察和測量得到細胞的剛度。Ni 等人在 cDC 基礎上設計了一種多通道并行的微流控芯片用以測試敲除Ptpn21蛋白的造血干細胞的流動變形能力，發(fā)現(xiàn)Ptpn21-/-的造血干細胞通過漸縮的微通道時的流動速度明顯比天然造血干細胞的速度更快，且更不易粘滯在微流控通道內(nèi)。

不同類型的干細胞具有不同的細胞剛度，即使是同類型的干細胞，在健康狀態(tài)和病理狀態(tài)下也有比較大的差異。長期以來，學界致力于在人類骨骼中鑒定并分離出各種類型的干細胞，卻一直難以確定可靠的細胞表面標志物、合適的組織解離方案和功能性干細胞試驗。Xavier 等人在經(jīng)典的 sDC 基礎上運用了實時可變形流式細胞術（Real-time deformability cytometry， RT-DC）分別測量了骨骼干細胞（間充質干細胞的一個亞群）、間充基質細胞以及白細胞的力學表型，發(fā)現(xiàn)這三類細胞在細胞尺寸、變形程度上表現(xiàn)出了顯著的差異。實驗表明骨骼干細胞的細胞剛度大于其他兩類細胞，利用細胞剛度差異來提高骨骼干細胞的分離效率具有顯著的生理治療意義和臨床轉化的潛力。

干細胞的剛度和尺寸均高于紅細胞，因此在微血管內(nèi)流動輸運顯然存在困難。對大鼠冠狀肌從小動脈到小靜脈的動脈內(nèi)的輸運過程中，跟蹤顯示 92%的間充質干細胞在毛細血管前水平的血管中發(fā)生了阻滯，導致局部缺血。Lipowsky及其團隊利用瞬態(tài)過濾實驗（Transient filtrationtest）給出了間充質干細胞所能通過毛細通道的直徑與壓強差之間的關系；同時，他們發(fā)現(xiàn)間充質干細胞在穿越與毛細血管尺寸相當?shù)耐ǖ罆r所需的驅動壓差超越了體內(nèi)真實毛細血管中的壓差數(shù)值，從而導致極高的微血管堵塞率；此外，他們還發(fā)現(xiàn)在細胞直徑與毛細通道直徑比大于1.56 臨界值時，能夠驅動間充質干細胞通過毛細通道的壓差值迅速上升，這與細胞直徑與細胞核直徑的平均比值（1.62±0.23SD）有直接關系。根據(jù)這一發(fā)現(xiàn)，許多學者開始研究干細胞的細胞核，并得出共同的結論：細胞核是決定干細胞力學特性的核心結構。于是，人們開始通過改良微吸管技術（Micropipette aspiration  technique）來提高測量干細胞及其細胞核力學表型的效率。Davidson 等人開發(fā)了一種高通量的新型微流體裝置和半自動成像分析通道（如圖 5a）來探測完整細胞中隨時間變化的細胞核力學行為。這種高通量的微吸管芯片可以在完整干細胞中以高分辨率觀察和量化的細胞核的變形，適用于并行測量四組不同類型的多個細胞數(shù)（每組 18 個通道），比傳統(tǒng)的單細胞微吸管實驗或原子力顯微鏡技術高 1-2 個量級。這種多通道微流控芯片設計允許快速加載、清洗細胞并進行測量，在提高測量效率的基礎上最大限度地減少細胞簇的堵塞。

3.2 基于微流控芯片系統(tǒng)的干細胞遷移行為研究

那些順利通過微血管關卡的干細胞將面臨更大的挑戰(zhàn)——遷移，即穿越直徑僅為 2-5 微米的血管內(nèi)皮細胞間的狹縫，并爬行至炎癥組織部位。干細胞遷移對其生理和病理過程都至關重要。為了在體外模擬這一特殊過程并量化細胞的主動遷移能力，Tong 等人設計了一種具有遷移室的微流控芯片系統(tǒng)，該遷移室利用可自我維持的趨化因子濃度梯度來誘導細胞在三維受限空間內(nèi)的遷移運動。然而，該遷移室通道的幾何形狀與真實的體內(nèi)生理微環(huán)境幾何形狀存在較大差異，基于此，Davidson 等人對細胞遷移微流控芯片設計進行了改良，使其微通道能夠模仿體內(nèi)內(nèi)皮細胞間狹縫的尺寸，從而能夠觀察到干細胞通過狹窄通道時產(chǎn)生的變形，以預測間充質干細胞在內(nèi)皮細胞間狹縫處的擠壓情況，量化間充質干細胞及其細胞核在仿生微通道中的遷移能力（如圖 5b）。類似地，他們團隊發(fā)現(xiàn)細胞核的變形能力是限制細胞在狹窄通道（2-5 微米）中遷移的一個重要因素。為了提高該微流控系統(tǒng)的檢測分析能力，Joshua 等人開發(fā)了一套 MATLAB 程序，用以追蹤細胞核在仿生狹縫中的運動軌跡、遷移時間和遷移成功率，同時可以檢測細胞及其核的完整性，將檢測分析時間從數(shù)周縮短到了數(shù)小時，并且可消除手動測量引起的誤差。

為了進一步提高干細胞的遷移效率，Wang等人通過離心將間充質干細胞進行去細胞核處理，并對去核間充質干細胞（Cargocyte）進行了遷移能力測試（如圖 5c）。通過與天然人源間充質干細胞（hT-MSC）的遷移實驗結果對比，發(fā)現(xiàn)Cargocyte 有效地通過了狹窄通道，而 hT-MSCs則經(jīng)常被捕獲在狹縫中。這一結果表明，去核干細胞比天然干細胞具有更好的變形能力，這與先前的研究結果一致：細胞核的硬度是周圍細胞質的 2 至 10 倍，并且細胞核與細胞骨架的物理解耦足以增加細胞骨架的變形能力。

微流控系統(tǒng)的不斷發(fā)展為研究人員提供了一個更真實、可控的仿生實驗平臺，幫助揭示干細胞生理行為中的關鍵問題，對干細胞療法的改良工作提供了大量潛在的策略。

圖 5（a）高通量微吸管實驗裝置示意圖：通過加載在三個位置的不同壓強實現(xiàn)負壓操作。干細胞的熒光染色圖像中，紅色熒光標記的組蛋白表示細胞核，綠色熒光標記肌動蛋白表示細胞質。（b）基于微流控芯片的干細胞跨內(nèi)皮遷移裝置。兩個紅色圓柱形儲液池設計用于產(chǎn)生趨化因子濃度梯度，有利于干細胞在綠色的空間受限區(qū)域中遷移。（c）hT-MSCs 和 Cargocyte 在微通道中沿 FBS 梯度沿縮窄移動的延時圖像序列。紅色顯示的是細胞骨架，藍色顯示的是細胞核。標尺長度為 50 μm。

根據(jù)細胞相關生理參數(shù)在細胞整體系統(tǒng)水平建立細胞數(shù)值模型，對于進一步理解細胞流變行為和生理狀態(tài)規(guī)律，預測各種環(huán)境擾動對細胞功能的影響并指導設計干細胞微流控實驗具有重要意義。鑒于數(shù)值模型模擬在紅細胞、白細胞流變行為研究中已經(jīng)有了廣泛應用，學者們也開始嘗試將數(shù)值模型模擬方法與微流控實驗結合起來，對干細胞流變和歸巢行為的力學影響機制進行深入研究。Qi 等人基于耗散粒子動力學（Dissipative particle dynamics，DPD）方法建立的干細胞歸巢行為數(shù)值模型作為研究干細胞跨內(nèi)皮遷移實時動態(tài)行為的模擬平臺，通過大規(guī)模并行計算實現(xiàn)了干細胞在流體力推動情況下擠壓通過仿生內(nèi)皮細胞間狹縫的動態(tài)過程觀測，同時，他們實現(xiàn)了干細胞跨內(nèi)皮遷移行為發(fā)生時細胞及其核的表面剪切應力變化、流場信息變化的數(shù)據(jù)捕捉、傳輸及自動入庫功能。現(xiàn)在，數(shù)值仿真技術與微流控芯片技術結合的研究方法應用得越來越廣泛，微流控實驗允許研究人員精確控制細胞所處微環(huán)境，數(shù)值仿真可以幫助研究人員快速進行參數(shù)優(yōu)化，以找到最佳實驗條件，從而節(jié)省時間和資源，減少實驗次數(shù)的同時還能提高實驗效率。此外，數(shù)值仿真可以深入人們對細胞變形、遷移的理解，有助于解釋實驗觀察到的現(xiàn)象。

4 結 論

隨著技術的不斷進步和創(chuàng)新，微流控技術將在細胞力學和生物醫(yī)學研究領域發(fā)揮越來越重要的作用，為人們對生命科學的理解和醫(yī)學診療技術的進步帶來更多的可能性。在本綜述中，我們總結了微流控技術以及基于微流控的數(shù)值仿真技術在血細胞及干細胞流變學行為方面的研究進展，并簡單展望了未來的發(fā)展趨勢。首先，我們介紹了微流控技術的基本原理，并闡述了其在生物醫(yī)學工程領域的重要作用。隨后，我們圍繞微流控技術及基于微流控技術的數(shù)值仿真方法在血細胞和干細胞兩大研究領域的應用展開了詳細討論。在血細胞領域，我們強調了微流控技術在紅細胞變形性分析和白細胞遷移行為研究中的關鍵作用。研究人員通過微流控芯片系統(tǒng)可以模擬不同的血流微環(huán)境，實時觀察血細胞的變形、遷移以及與周圍環(huán)境的相互作用，為生理與病理條件下的血細胞力學和血流動力學的研究提供了新的視角。在干細胞領域，我們強調了微流控技術在研究干細胞力學特性和血流微環(huán)境對干細胞歸巢行為影響方面的應用。微流控技術使得研究者可以更直觀地觀察和分析干細胞的變形性、遷移能力以及與周圍細胞的相互作用，為再生醫(yī)學和組織工程領域的研究提供了新的思路和手段。基于微流控實驗的數(shù)值仿真在這一領域的發(fā)展幫助研究人員們快速優(yōu)化實驗條件，找到潛在的關鍵參數(shù)，能夠有效提高實驗效率。

微流控芯片技術的微尺度、微循環(huán)的特性，可以精確考察控制單細胞尺度微環(huán)境; 但目前還難以滿足血管力學特性的模擬，在體外模擬血管壁彈性、內(nèi)皮粘附能力和滲透等功能方面仍面臨一系列挑戰(zhàn)。同時，由于血細胞和干細胞所處的細胞力學微環(huán)境十分復雜并且在持續(xù)變化，微流控芯片還不能完全復現(xiàn)細胞所處小生境。隨著增材制造技術和 3D 打印等技術的蓬勃發(fā)展，人們有望構建仿真人造血管等方式來實現(xiàn)生物材料的非線性和各向異性，從而為血細胞及干細胞流變學行為分析的后期研究和應用提供有力實驗平臺。此外，GPU 加速的大規(guī)模并行數(shù)值模擬技術、機器學習等新興方法與微流控技術的結合，也會為未來的細胞流變學領域的基礎研究及干細胞療法的臨床應用研究提供有力支撐。

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