開(kāi)發(fā)具有與原生絲相似特性的人造蜘蛛絲一直是材料科學(xué)中一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。在這項(xiàng)研究中，我們使用微流控裝置來(lái)創(chuàng)建基于重組 MaSp2 螺蛋白的連續(xù)纖維。該策略結(jié)合了離子誘導(dǎo)的液-液相分離、pH 驅(qū)動(dòng)的纖維顫動(dòng)和剪切依賴性誘導(dǎo)β片形成。我們發(fā)現(xiàn)纖維形成需要大約 72 Pa 的閾值剪切應(yīng)力，并且β片的形成取決于重復(fù)序列中聚丙氨酸塊的存在。所形成的MaSp2纖維的β片含量（29.2%）與剪切應(yīng)力要求為111 Pa的天然吊斗鏟相當(dāng)，有趣的是，聚丙氨酸塊對(duì)液-液相分離和分層結(jié)構(gòu)的影響有限。研究結(jié)果為蜘蛛絲剪切誘導(dǎo)結(jié)晶及層織關(guān)系提供了新的發(fā)展思路，對(duì)人工紡絲纖維的合理設(shè)計(jì)具有重要意義。

蜘蛛拉鏟絲是一種基于蛋白質(zhì)的生物聚合物，體現(xiàn)了無(wú)與倫比的強(qiáng)度和柔韌性組合，引起了廣泛的科學(xué)興趣。在實(shí)驗(yàn)室中，已經(jīng)做出了各種努力，從螺蛋白前體成分中生產(chǎn)合成的吊索絲;然而，復(fù)制天然纖維的機(jī)械性能仍然是一個(gè)艱巨的挑戰(zhàn)。這也許不足為奇，因?yàn)槔鹘z的性能源于其復(fù)雜的分層子結(jié)構(gòu)，為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，蜘蛛采用了一種復(fù)雜的機(jī)制，該機(jī)制通過(guò)模塊化螺旋體結(jié)構(gòu)域中的構(gòu)象變化來(lái)協(xié)調(diào)，響應(yīng)精確定時(shí)的化學(xué)觸發(fā)，結(jié)合在絲腺旋轉(zhuǎn)管道的有限幾何形狀內(nèi)產(chǎn)生的物理力.

人造絲紡絲的經(jīng)典方法通常涉及通過(guò)惡劣的變性條件（例如濕紡中的酒精凝固浴）將非天然蛋白質(zhì)原料轉(zhuǎn)化為纖維材料。然而，最近，人們?cè)絹?lái)越有興趣應(yīng)用仿生技術(shù)在生態(tài)良性的條件下生產(chǎn)具有類似天然結(jié)構(gòu)和功能的纖維。在這里，重點(diǎn)是復(fù)制微妙的生化過(guò)程，這些過(guò)程協(xié)同作用使蠶絲纖維在自然系統(tǒng)中自組裝。這些事件包括液-液相分離 （LLPS），這被認(rèn)為是多種蛋白質(zhì)纖維預(yù)組裝的關(guān)鍵步驟，并且在螺旋體中，它通過(guò)重復(fù)結(jié)構(gòu)域 （RPD） 和 C 末端結(jié)構(gòu)域 （CTD） 進(jìn)行調(diào)節(jié)，以響應(yīng) kosmotropic 離子的梯度，例如磷酸鹽。同時(shí)，酸化梯度通過(guò) N 末端結(jié)構(gòu)域 （NTD） 介導(dǎo)螺旋蛋白鏈的快速端到端多聚化，以及 CTD的去折疊。剪切和伸長(zhǎng)流等流變效應(yīng)也是主要考慮因素，因?yàn)樗鼈兇龠M(jìn)了紡絲管道內(nèi)螺旋蛋白鏈的逐漸排列，并啟動(dòng)了廣泛的 RPD 從基本無(wú)序狀態(tài)向有序分子間相互作用的轉(zhuǎn)換，從而能夠形成分散的β片納米晶體，從而賦予纖維更高的強(qiáng)度.

微流控技術(shù)在結(jié)構(gòu)蛋白的組裝中呈現(xiàn)出令人興奮的前沿，其中復(fù)雜的宏觀結(jié)構(gòu)可以構(gòu)建，至少在理論上，通過(guò)定制的通道排列和所需的時(shí)間順序以靈活的方式引入相關(guān)的生理觸發(fā)器。事實(shí)上，對(duì)于人造絲紡紗，基于微流控的方法被認(rèn)為比更傳統(tǒng)的技術(shù)具有促進(jìn)類似天然纖維組裝的最大潛力。特別是，旋轉(zhuǎn)管道的受限尺寸和幾何形狀決定了關(guān)鍵的流動(dòng)參數(shù)，可以在芯片中小型化通道的設(shè)計(jì)中得到近似。

先前的研究報(bào)道了在紡紗人造蜘蛛絲中結(jié)合微流體原理。在仿生保真度方面，這些方法包括各種重組螺旋蛋白序列、微流控芯片設(shè)計(jì)、化學(xué)觸發(fā)成分以及所應(yīng)用的關(guān)鍵處理步驟的外化。一個(gè)值得注意的例子顯示，通過(guò)在微流控裝置中連續(xù)引入磷酸根離子和 pH 值降低，使用三域 ADF3 螺旋體形成纖維。然而，至關(guān)重要的是，以前的研究沒(méi)有報(bào)道過(guò)具有多級(jí)納米級(jí)亞結(jié)構(gòu)的纖維的生產(chǎn)，這是天然絲綢自組裝的標(biāo)志。補(bǔ)充表1總結(jié)了重組螺旋體微流控紡絲的差異比較。有趣的是，對(duì)于再生絲素蛋白（RSF）的紡絲，微流控芯片內(nèi)部產(chǎn)生的力已被量化，以顯示沿通道的剪切和伸長(zhǎng)率的分布，揭示了這些力與β片內(nèi)容物之間的關(guān)系。然而，在重組螺旋體的情況下，尚未對(duì)微流體通道內(nèi)的力進(jìn)行這種定量分析，以將力與纖維的形成和構(gòu)象的變化聯(lián)系起來(lái)。與RSF相比，天然狀態(tài)下的重組螺旋體對(duì)導(dǎo)致自組裝行為的自然發(fā)生的觸發(fā)因素反應(yīng)更靈敏。因此，量化類天然條件下的剪切應(yīng)力等力對(duì)于更好地理解蜘蛛絲自組裝機(jī)理具有重要意義和意義。

在這里，我們提出了一個(gè)合理設(shè)計(jì)的微流控系統(tǒng)，旨在通過(guò)整合有關(guān)體內(nèi)自組裝過(guò)程的最新見(jiàn)解來(lái)模擬天然絲紡設(shè)備的功能。通過(guò)連續(xù)施用觸發(fā)相分離和納米纖維形成的仿生化學(xué)梯度，以及通過(guò)可量化的剪切效應(yīng)，我們證明了來(lái)自重組 MaSp2 前體的多級(jí)結(jié)構(gòu)絲纖維的完整原位組裝，具有可調(diào)的β片豐度和近乎瞬時(shí)的速度。

仿生微流控裝置的電子標(biāo)志

我們旨在設(shè)計(jì)一種仿生微流控裝置，該裝置近似通道內(nèi)的天然化學(xué)和物理梯度，用于研究蜘蛛絲纖維組裝。該芯片的架構(gòu)如圖1a所示。它包括 3 個(gè)入口，即（1）前體螺旋體溶液、（2）中性 pH 下的 kosmotropic 離子和（3）低pH值顫化觸發(fā)器。該架構(gòu)提供了兩個(gè)順序混合區(qū)域，然后是終止于出口的擴(kuò)展通道，并沿設(shè)備定義了三個(gè)區(qū)域，用于監(jiān)控自組裝的連續(xù)階段（A、B 和 C 部分）。該設(shè)計(jì)合理化如下：在流動(dòng)開(kāi)始時(shí)，源自 （1） 和 （2） 的流合并，使螺旋體暴露于類似于蜘蛛紡導(dǎo)管中發(fā)現(xiàn)的 kosmotropic 陰離子梯度，預(yù)計(jì)會(huì)觸發(fā) MaSp2 的 LLPS，新生的蛋白質(zhì)液滴通過(guò)層流通過(guò) A 部分向下游輸送。 隨后沿相反方向與源自 （3） 的流接觸會(huì)產(chǎn)生 pH 梯度， 它模擬了自然酸化效應(yīng)，并有望觸發(fā)螺旋體冷凝物凝固成纖維狀網(wǎng)絡(luò)（B 部分）。C部分構(gòu)成一個(gè)尺寸為2 cm×80 μm×62 μm的直通道，預(yù)計(jì)機(jī)械變形會(huì)促進(jìn)延伸絲狀纖維的組裝。

需要說(shuō)明的是，我們選擇了一種簡(jiǎn)化的設(shè)計(jì)，其中每個(gè)單獨(dú)的通道都具有均勻的橫截面，并且寬度從B（60μm）增加到C（80μm），以便關(guān)注剪切在調(diào)節(jié)纖維組裝和結(jié)晶方面的影響，同時(shí)最大限度地減少拉伸流的影響。這與天然紡絲管道中發(fā)現(xiàn)的更復(fù)雜（即收斂）幾何形狀形成鮮明對(duì)比，在自然紡紗管道中，管道朝向噴絲頭逐漸變窄會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)大的拉伸流，有助于絲分子的排列。值得注意的是，我們系統(tǒng)中的樣品流是通過(guò)從出口施加負(fù)壓（真空）來(lái)啟動(dòng)的，這在以前的絲狀纖維組裝策略中并不常見(jiàn)，其中流動(dòng)通常通過(guò)正壓23或注射器泵送28,29技術(shù)產(chǎn)生;這是為了模仿天然絲纖維從生物體中“拉出”而不是被“推出”的觀察結(jié)果（拉擠）14,30;此外，這還能夠?qū)ξ⒘黧w裝置內(nèi)產(chǎn)生的力進(jìn)行微調(diào)控制。

從LLPS到納米纖顫再到纖維形成的類天然絲組裝

作為蜘蛛絲構(gòu)建單元，我們使用了重組 MaSp2 吊索螺旋體，具有一系列結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)（圖 1b），包括 N-R6-C 和 N-R12-C 的完整構(gòu)建體（分別具有 6 個(gè)和 12 個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列）、截短構(gòu)建體 N-R6-x、x-R6-C 和 x-R6-x，以及用交替甘氨酸和絲氨酸殘基 （GSGSGSG） 替換聚丙氨酸塊的三結(jié)構(gòu)域 N-R12-C（xA） 變體， 評(píng)估纖維組裝過(guò)程中β片形成的順序依賴性。制備的螺旋體通過(guò)SDS-PAGE確認(rèn)。

在微流體系統(tǒng)之外，通過(guò)暴露于中性pH值下的科斯級(jí)離子，可以很容易地誘導(dǎo)三域MaSp2形成LLPS液滴（圖1c），而在酸性條件（pH 5.5-5.0）下，LLPS和NTD介導(dǎo)的多聚化的聯(lián)合效應(yīng)產(chǎn)生了自發(fā)和快速的網(wǎng)絡(luò)組裝（圖1c）。在這項(xiàng)研究中，我們使用混合檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液 （CPB） 系統(tǒng)作為一般的 kosmotropic 觸發(fā)因素，因?yàn)榕c單個(gè)磷酸鹽和檸檬酸鹽成分相比，它在相關(guān) pH 值范圍 （7.5–5.0） 內(nèi)的緩沖能力有所提高。

逐步仿生過(guò)程被集成到微流控系統(tǒng)中，并優(yōu)化為以最小的干預(yù)生成分層結(jié)構(gòu)的 MaSp2 纖維。該方法本身只需在恒定負(fù)壓下在入口 3、2 和 1 處依次添加組件，然后立即停止泵。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)建立了有效纖維形成的條件，我們將其定義為在微流體通道內(nèi)產(chǎn)生單個(gè)連續(xù)纖維，不包括纖維斷裂或聚集體或其混合物的形成。在這里，發(fā)現(xiàn)纖顫緩沖液的組成至關(guān)重要，在濃度在1-1.5 M和pH值為5.0之間時(shí)，CPB以及施加壓力的大小以及所施加壓力的大小都獲得了最佳結(jié)果。

圖2a概述了在?90 kPa壓力下，在50 mg/ml（入口1）、50 mM CPB pH 7.0（入口2）和1.0 M CPB pH 5.0（入口3）下使用標(biāo)記構(gòu)建體N-R12-C獲得的結(jié)果。在整個(gè)通道長(zhǎng)度上可以觀察到凝聚的 MaSp2 結(jié)構(gòu)，通過(guò)器件的連續(xù)階段，中尺度形態(tài)發(fā)生了明顯的演變。沿著A段，入口1一側(cè)的通道壁上密布著大致呈球形或無(wú)定形的MaSp2冷凝物沉積物，具有部分液滴融合和表面潤(rùn)濕特性，與LLPS的形成和蛋白質(zhì)液滴通過(guò)層流向下游遷移一致（圖2a-c）。該結(jié)果與液滴的動(dòng)態(tài)形成和融合行為一致，如圖1c所示。盡管緩沖相和層流觸發(fā)器之間的表面接觸相對(duì)有限，但MaSp2能夠進(jìn)行廣泛的LLPS，這一事實(shí)表明初始條件接近相分離邊界，這確保了當(dāng)兩股流接觸時(shí)迅速相分離。

在B段中，MaSp2凝聚水轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂蓄w粒表面的扁平片狀形態(tài)，這是由酸化梯度的綜合效應(yīng)引發(fā)的突然變化，酸化梯度觸發(fā)了纖維化，以及通道幾何形狀變化引起的剪切效應(yīng)。除了B部分形態(tài)的明顯變化外，螺旋體的相應(yīng)結(jié)構(gòu)還受到該纖維化階段引入的化學(xué)和物理觸發(fā)因素的影響（見(jiàn)下文）。再往下游，在C部分，我們看到在整個(gè)通道長(zhǎng)度上形成了連續(xù)的不間斷纖維，圓直徑為5-10μm。在這里，纖維的分層子結(jié)構(gòu)非常明顯，由沿縱軸取向的密集堆積的納米原纖維組成（圖2d，e;補(bǔ)充電影 2），驗(yàn)證了仿生自組裝策略。實(shí)際上，在設(shè)備C部分中形成的對(duì)齊納米纖維束可以被認(rèn)為是類似于在pH 5下將MaSp2與CPB混合時(shí)在設(shè)備外部組裝隨機(jī)蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（圖1c），由通道內(nèi)的定向流動(dòng)提供原纖維排列的額外因素;換句話說(shuō)，在蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)單軸取向后，2D網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可以轉(zhuǎn)化為1D納米纖維。形成后，可以從設(shè)備中回收纖維以進(jìn)行進(jìn)一步分析。值得注意的是，纖維能夠在純水中保持結(jié)構(gòu)完整性并表現(xiàn)出高柔韌性（圖2f）。在一些局部區(qū)域，整體纖維結(jié)構(gòu)確實(shí)破裂了，這清楚地揭示了一個(gè)由具有高縱橫比的單個(gè)蛋白質(zhì)原纖維組成的底層亞結(jié)構(gòu)，并沿纖維的縱軸取向圖2g。在補(bǔ)充電影 3 中展示了構(gòu)建體 N-R12-C 纖維組裝后微流控裝置的整個(gè)長(zhǎng)度的可視化，這提供了分層組織的進(jìn)一步證據(jù)。

有趣的是，雖然完整的結(jié)構(gòu)（即 N-R6-C 和 N-R12-C）產(chǎn)生了具有微觀下無(wú)法區(qū)分形態(tài)的纖維，但截短的變體 N-R6-x、x-R6-C 和 x-R6-x 在相同條件下未能產(chǎn)生任何纖維，這強(qiáng)調(diào)了不同結(jié)構(gòu)域之間在天然條件下成功自組裝蜘蛛絲的關(guān)鍵相互作用12。此外，雖然缺乏聚丙氨酸塊的三結(jié)構(gòu)域N-R12-C（xA）在A和B段中表現(xiàn)出與N-R6-C和N-R12-C結(jié)構(gòu)相似的形態(tài)，但C段產(chǎn)生的纖維結(jié)構(gòu)經(jīng)常在通道內(nèi)破裂，反映了這些結(jié)構(gòu)的明顯力學(xué)弱點(diǎn)。

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