微型化是現(xiàn)代分析儀器發(fā)展的重要趨勢(shì)。微型化液相色譜儀器在提供與常規(guī)尺度液相色譜相同甚至更高分離效率的同時(shí),可以有效減少溶劑和樣品的消耗;在液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用中,低流速進(jìn)樣可以有效提高質(zhì)譜離子源的離子化效率,提高質(zhì)譜檢測(cè)效率;對(duì)于極微量樣品的分離,微型化的液相色譜可以有效減少樣品稀釋;液相色譜的微型化還有利于液相色譜儀器整體的模塊化和集成化設(shè)計(jì)。芯片液相色譜是在微流控芯片上制備色譜柱并集成相應(yīng)的流體控制系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng)。芯片液相色譜是色譜儀器微型化的一種重要方式,受到學(xué)術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界的普遍關(guān)注,但是這一方式也充滿挑戰(zhàn)。液相色譜微流控芯片需要在芯片基底材料、芯片色譜柱的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)、微流體控制技術(shù)、檢測(cè)器技術(shù)等方面做出創(chuàng)新,使微流控芯片系統(tǒng)適配液相色譜分離技術(shù)的需要。目前芯片液相色譜領(lǐng)域面臨的主要問題在于芯片基底材料的性質(zhì)難以滿足芯片液相色譜進(jìn)一步微型化和集成化的需求;因此芯片液相色譜在未來的發(fā)展中需要著重關(guān)注新型微流控芯片基底材料的開發(fā)以及微流控芯片通道結(jié)構(gòu)的統(tǒng)一設(shè)計(jì)。該文著重介紹了芯片液相色譜技術(shù)近年來的研究進(jìn)展,并簡要展示了商品化芯片色譜當(dāng)前的發(fā)展情況。

微型化已成為現(xiàn)代分析儀器發(fā)展的一個(gè)重要趨勢(shì)。微型化的分析系統(tǒng)可以有效地減少樣品和試劑的消耗,提高檢測(cè)效率,降低檢測(cè)成本。作為重要的分離分析手段,色譜儀器的微型化也是分離科學(xué)未來發(fā)展的重要趨勢(shì)。從色譜儀器的角度看,微型化可以帶來的優(yōu)勢(shì)包括: (1)溶劑消耗量的大幅減少,理想狀態(tài)下相較于常規(guī)色譜系統(tǒng)可減少溶劑消耗近3個(gè)數(shù)量級(jí);(2)樣品需求量下降,適合生物組學(xué)研究等無法獲得大量樣品的分析領(lǐng)域;(3)快速的分離分析;(4)有利于色譜裝置的模塊化、集成化設(shè)計(jì)。此外,在液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用中,由于電噴霧離子源(ESI)的離子化效率與前端色譜流速的倒數(shù)具有線性關(guān)系,色譜微型化帶來的低流速可以有效適配ESI-MS,適用于分析生物組學(xué)研究中常見的微量復(fù)雜樣品。

基于微流控芯片平臺(tái)的液相色譜被稱為芯片液相色譜。得益于微機(jī)電技術(shù)(MEMS)強(qiáng)大的微結(jié)構(gòu)加工能力,相較于另一類微型化色譜——毛細(xì)管液相色譜,芯片液相色譜具有更高的靈活度和可集成性,在微型化、模塊化、智能化、自動(dòng)化等方面,芯片液相色譜具有更好的發(fā)展前景。目前,芯片液相色譜可以良好地實(shí)現(xiàn)常規(guī)液相色譜的富集、分離等功能,產(chǎn)業(yè)界也在芯片液相色譜商品化上取得一定成果。本文將著重介紹近年來芯片液相色譜技術(shù)在學(xué)術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界的最新進(jìn)展,并展望芯片液相色譜技術(shù)未來的發(fā)展方向。

1 芯片色譜系統(tǒng)

芯片色譜系統(tǒng)的設(shè)計(jì)、加工、使用是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)工程。根據(jù)具體分離任務(wù)的需要,芯片基底材料的選擇、色譜固定相的選擇、芯片通道結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)與制造、流體驅(qū)動(dòng)方式以及芯片連接方式的選擇、檢測(cè)器的選擇與聯(lián)用、特殊色譜結(jié)構(gòu)或方法的聯(lián)用,各個(gè)要素相互影響、相互牽制,每一個(gè)要素都具有重要的作用。

1.1 芯片基底材料

芯片基底材料的選擇需要綜合考慮材料的特性(硬度、形變模量、化學(xué)惰性、吸光性質(zhì)、吸脫附性質(zhì)、生物兼容性等),并根據(jù)所擁有的加工手段以及分離分析的具體條件來決定。最早使用的芯片色譜基底材料是硅。由于早期微流控芯片加工工藝大部分直接繼承自微機(jī)電加工技術(shù),硅自然成為工程師們最為熟悉的芯片材料。硅材料具有較高的硬度和良好的化學(xué)惰性,適用于絕大多數(shù)色譜方法,因此硅在早期芯片液相色譜領(lǐng)域內(nèi)有很多應(yīng)用。但是,硅在紫外以及可見光區(qū)無法透射,這導(dǎo)致在硅芯片上直接原位使用光學(xué)檢測(cè)較為困難。因此,人們常用玻璃或石英材料替換硅。玻璃以及石英具有出色的化學(xué)穩(wěn)定性、機(jī)械強(qiáng)度、優(yōu)良的生物兼容性和可衍生能力,同時(shí)還具有極高的透射率。Belder課題組在玻璃芯片上開展了系統(tǒng)性的工作。他們?cè)O(shè)計(jì)了一整套標(biāo)準(zhǔn)化的玻璃芯片器件(見圖1a),這些芯片結(jié)合了液相色譜分離與ESI離子源,并配備了高壓不銹鋼夾具用于芯片與外部設(shè)備的連接。這種高壓不銹鋼夾具可以承受高達(dá)36 MPa的流體壓力,同時(shí)還可以實(shí)現(xiàn)極低死體積(約2~10 nL)的側(cè)向芯片連接。Mellors等設(shè)計(jì)了一種毛細(xì)管電泳芯片并與ESI-MS聯(lián)用,他們將矩形芯片的一個(gè)角直接作為ESI噴口,證明了玻璃芯片可以直接作為ESI離子源的噴口。利用玻璃對(duì)高溫的耐受性,Heiland等開發(fā)了具有溫度梯度洗脫功能的玻璃色譜芯片,并用于分離多環(huán)芳烴。這種溫度梯度芯片可在以4 ℃/s的溫度梯度升溫至200 ℃的梯度條件下工作。該課題組還利用玻璃材料優(yōu)良的穩(wěn)定性和機(jī)械強(qiáng)度,在同一套玻璃芯片的基礎(chǔ)上開發(fā)了芯片超臨界流體色譜(supercritical fluid chromatography, SFC)聯(lián)用雙光子激發(fā)(two-photon excitation, TPE)熒光光譜裝置。這一裝置可在20 s內(nèi)完成色譜分離,且在20 mm/s的高流速下仍能得到高度對(duì)稱的色譜峰。

圖 1   芯片色譜基底材料

與硅和玻璃材料相比,聚合物基底材料具有更良好的加工性能,是目前微流控芯片領(lǐng)域最常用的芯片基底材料。基于聚合物材料,人們已發(fā)展了豐富的加工技術(shù),如激光燒灼技術(shù)、軟光刻技術(shù)、噴射造型技術(shù)等。這些穩(wěn)定且成熟的物理加工手段使得聚合物芯片具有較高的批次間重現(xiàn)性。然而,聚合物芯片在化學(xué)穩(wěn)定性和機(jī)械強(qiáng)度方面,要普遍遜色于石英芯片和玻璃芯片。聚二甲基硅氧烷(PDMS)是目前應(yīng)用最為廣泛的聚合物微流控芯片材料,PDMS具有優(yōu)良的透光率和生物兼容性。同時(shí),PDMS還極為柔軟(彈性模量約為500~4000 kPa),只需要施加一個(gè)大氣壓的壓力就可以引起PDMS一個(gè)維度上近10%的形變。這使得PDMS相比玻璃芯片可以更容易地實(shí)現(xiàn)芯片與其他設(shè)備的連接,甚至可以在PDMS芯片通道內(nèi)直接加工泵閥結(jié)構(gòu)。但PDMS的缺點(diǎn)亦十分明顯: PDMS材料在常用的色譜流動(dòng)相溶劑中易發(fā)生溶脹;其較強(qiáng)的吸附性質(zhì)和透氣性會(huì)導(dǎo)致較嚴(yán)重的色譜峰展寬;低彈性模量使得PDMS芯片無法承受高流體壓力,不適合高效液相色譜這類流體背壓較大的色譜方法。以上諸多問題使得PDMS材料在芯片色譜領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用受到較大限制。但PDMS作為極易加工和批量生產(chǎn)的芯片材料,在微流控領(lǐng)域常作為原型設(shè)計(jì)使用。熱塑性材料(thermoplastics)的高分子鏈結(jié)構(gòu)更加緊密,在加熱到玻璃化轉(zhuǎn)變溫度時(shí)熱塑性材料會(huì)由固態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂幸欢鲃?dòng)性的狀態(tài),其冷卻后會(huì)固定形態(tài)的性質(zhì)稱為熱塑性。熱塑性的芯片材料有:聚碳酸酯(PC)、聚甲基丙烯酸酯(PMMA)、環(huán)烯烴共聚物(copolymers of cycloolefin, COC)等。相比于以PDMS為代表的彈性體(elastomer),熱塑性材料具有更高的機(jī)械強(qiáng)度(如PMMA彈性模量可達(dá)3.2 GPa)、更強(qiáng)的抗溶劑腐蝕性能和更優(yōu)良的可加工性。Wouters等開發(fā)了基于COC的高效液相色譜芯片系統(tǒng)(見圖1b),他們利用微銑削技術(shù)直接在COC基底上銑出芯片通道,通過溶劑-真空輔助鍵合技術(shù)封裝芯片,配合特別設(shè)計(jì)的芯片接口制成在38 MPa壓力下可長時(shí)間運(yùn)行的COC液相色譜芯片,并利用這一系統(tǒng)完成了烷基苯酮的快速分離。還有一些特殊的芯片基底材料,如鈦、陶瓷、鉆石等,基于它們極高的機(jī)械強(qiáng)度、極強(qiáng)的耐腐蝕性能、極高的熱穩(wěn)定性等原因,也被嘗試應(yīng)用于芯片色譜基底材料。但由于它們較為苛刻的加工和制造條件,目前這幾類芯片基底材料還沒有被大規(guī)模的應(yīng)用。

1.2 芯片色譜柱

最早投入使用的芯片色譜柱結(jié)構(gòu)是開管柱(open-tube)。開管柱床的制備是在色譜柱通道內(nèi)壁上修飾硅烷、凝膠、聚合物等作為固定相。開管柱因其中空的柱床結(jié)構(gòu)而具有最小的分離阻抗,開管柱床可以相對(duì)容易地在芯片孔道內(nèi)實(shí)現(xiàn)。但其中空的結(jié)構(gòu)也導(dǎo)致開管柱的柱床比表面積低,相比低,色譜柱容量小。提高開管柱柱容量的關(guān)鍵是提高固定相層的比表面積。Collins等利用光引發(fā)聚合反應(yīng)在毛細(xì)管上可控地生成聚合物開管柱床(見圖2a),所獲得柱床厚度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在±0.8%,實(shí)現(xiàn)了高度可控的開管柱床制備。Yang等在制備柱床時(shí),將聚合物前體與商品化的色譜填料顆?；旌献⑷肟涛g好的柱管,之后用紫外光引發(fā)聚合反應(yīng)。生成的聚合物層將填料顆粒包裹并固定在管壁上形成柱床。這些工作在一定程度上改善了開管柱的上樣量,但仍無法從根本上解決開管柱的柱容量問題。

圖 2   芯片色譜柱床電子顯微鏡照片

填充柱床(packed bed)是將預(yù)先制備好的固定相填料顆粒通過流體帶動(dòng)填裝進(jìn)色譜柱管形成的色譜柱床。填充柱具有顯著優(yōu)于開管柱的比表面積。由于柱管內(nèi)充滿填料顆粒,填充柱流體背壓通常可以達(dá)到5~40 MPa。得益于色譜固定相技術(shù)數(shù)十年間的發(fā)展,填充柱擁有種類和功能都十分豐富的色譜固定相庫可供選擇。在微流控芯片上制備填充床需要解決兩個(gè)問題:(1)如何將填充顆粒固定在芯片孔道內(nèi);(2)如何提高填料裝填的重現(xiàn)性。固定填料顆粒常用的方法是在微流控芯片通道內(nèi)構(gòu)建柱塞(frit)結(jié)構(gòu)。柱塞結(jié)構(gòu)可以通過微加工手段制得,也可以利用原位聚合反應(yīng)制備聚合物柱塞。Thurmann等利用激光輔助的光聚合手段在芯片通道中原位聚合生成一段約100 μm長的多孔聚合物整體柱塞。之后進(jìn)行顆粒填料裝填形成色譜柱床,最后在柱床末端再聚合制備一段柱塞完成色譜柱床兩頭的固定。這種不到100 μm長的多孔聚合物整體柱塞能承受25 MPa的裝填壓力,可以很好地滿足芯片柱裝填和使用的承壓要求。Huft等利用PDMS的柔性,設(shè)計(jì)了一種多層PDMS多柱液相色譜芯片,并應(yīng)用于免疫球蛋白基因逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分離純化。這一芯片通過微閥擠壓芯片孔道形成局部錐形結(jié)構(gòu),利用基石效應(yīng)(keystone effect)將色譜填料固定在柱管內(nèi)。同時(shí),他們還在芯片柱管壁上加工了大量微型旁路陣列,極大地減小了裝填時(shí)的阻力,可有效輔助填料在PDMS孔道內(nèi)的裝填。旁路陣列在進(jìn)行色譜分離時(shí)會(huì)通過微波照射封閉,不影響正常的色譜分離。本課題組的單顆粒柱塞技術(shù)也被運(yùn)用到芯片填充柱的制備上。單顆粒柱塞是一種多孔的硅球顆粒,其顆粒尺寸略大于分離通道尺寸,此前常用于各類毛細(xì)管色譜柱的制備。使用時(shí),只需將單顆粒直接塞入通道即可形成柱塞,使用方便可靠。Li等將多孔的單顆粒柱塞安裝進(jìn)入芯片通道內(nèi)用于固定填充柱床,制備好的芯片柱可在約34.4 MPa的高壓下工作。該芯片可在5 min內(nèi)完成3種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的分離,理論塔板數(shù)達(dá)到100000塊/米。柱塞結(jié)構(gòu)并非固定柱床的唯一方法,另一種方法是基于納米微球顆粒自組裝形成填充柱床。Shaabani等將甲基丙烯酸-2-羥基乙酯(HEMA)和二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)、光引發(fā)劑、致孔劑以及二氧化硅納米顆?；旌虾笞⑷隤DMS芯片的通道。通過光引發(fā)使HEMA和EDMA聚合,聚合過程中二氧化硅納米顆粒發(fā)生自組裝相互交聯(lián)形成膠體自組裝(colloidal self-assemble, CSA)柱床(見圖2b)。該芯片在7天時(shí)間內(nèi)進(jìn)行28次蛋白質(zhì)分離實(shí)驗(yàn),蛋白質(zhì)的洗脫時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于0.83%,芯片分離能力穩(wěn)定。同一蛋白質(zhì)片段在不同芯片(3片芯片)間洗脫時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.3%,芯片間也有較好的重現(xiàn)性。納米填料顆粒自組裝形成的柱床具有較高的重現(xiàn)性,且對(duì)裝柱技術(shù)要求較低。但由于納米顆粒粒徑極小,導(dǎo)致柱背壓極大,因此除了電色譜方法外,其他液相色譜方法難以在納米顆粒自組裝柱床上使用。

整體柱床(monolithic bed)是一種通過聚合反應(yīng)在色譜柱管內(nèi)原位合成的固定相結(jié)構(gòu)。相比于填充柱,整體柱的流阻較小,且不需要柱塞結(jié)構(gòu)來固定柱床。相比于開管柱,整體柱具有更高的比表面積和柱容量。其原位聚合的模式也使整體柱在芯片色譜領(lǐng)域的應(yīng)用備受關(guān)注。整體柱床主要的缺陷是: (1)聚合反應(yīng)可控性較差,柱間重現(xiàn)性較難保證;(2)聚合反應(yīng)的化學(xué)環(huán)境對(duì)芯片材料的選擇有限制;(3)在聚合反應(yīng)前后,整體柱床的尺寸常發(fā)生一定“縮水”,容易導(dǎo)致柱床脫落。Kendall等開發(fā)了一種非原位的整體柱床制備方法。他們首先在一個(gè)芯片模具中制備整體柱床,之后拆開模具芯片并取出柱床。在對(duì)柱床做衍生化處理后,再將其放入一個(gè)通道尺寸縮小10%的芯片,最后封閉芯片完成制備。這種制備方式雖然失去了整體柱原位聚合的優(yōu)點(diǎn),但換來的是尺寸更加可控的整體柱床制備。在解決柱床收縮問題的同時(shí),還可以實(shí)現(xiàn)不同功能化的柱床聯(lián)用,實(shí)現(xiàn)多維分離。除了常見的有機(jī)聚合物整體柱床,無機(jī)材料也被應(yīng)用于芯片整體柱的制備:Zhai等開發(fā)了一種基于氧化石墨烯硅烷聚合物的分子印跡整體材料芯片色譜柱(見圖2c),并用于分離富集辣椒粉中的羅丹明B。他們將氧化石墨烯(GO)與3-氨丙基三乙氧基硅烷耦聯(lián)生成氧化石墨烯硅烷(GO/SiO2),之后通過交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)與GO/SiO2反應(yīng)生成整體柱床。該芯片色譜柱對(duì)羅丹明B富集因子可達(dá)110,檢出限為0.40 ng/g。

柱陣列柱床(pillar array bed)是芯片色譜獨(dú)有的柱床結(jié)構(gòu)。柱陣列柱床的原型是一種被稱為COMOSS(collocated monolithic support structure)的微流控芯片結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)由大量規(guī)則排列的微柱組成,通常是通過光刻結(jié)合深反應(yīng)離子刻蝕(DRIE)技術(shù)加工制成?；谖锢砑庸な侄蔚闹圃旆椒ㄊ沟弥嚵兄簿哂袠O高的重現(xiàn)性,并且可以批量復(fù)制。單純的COMOSS結(jié)構(gòu)比表面積較低,樣品載量低,作為色譜柱床使用需要對(duì)微柱陣列進(jìn)行額外的修飾。Lincoln等研究了在柱陣列表面修飾多孔層的厚度對(duì)柱效以及保留時(shí)間的影響。多孔層厚度的增加對(duì)理論塔板數(shù)的提升較小,但保留性能會(huì)有明顯的增加。同時(shí),極大提高的比表面積也對(duì)柱陣列柱床的載樣能力有顯著提升。Desmet課題組對(duì)柱陣列色譜(pillar array chromatography, PAC)技術(shù)的成熟完善以及應(yīng)用做了較為系統(tǒng)的工作(見圖2d),包括:柱陣列色譜柱的制備、流體動(dòng)力學(xué)模型、柱陣列多孔層研究、柱陣列長柱制備等方面。尤其在柱陣列芯片色譜長柱制備上,Desmet課題組做出了系統(tǒng)性的工作。Baca等利用串聯(lián)4張柱長為2 m的柱陣列色譜芯片得到的8 m長的柱陣列色譜柱分離小分子混合物,在2050 min的梯度時(shí)間內(nèi)得到了1815的峰容量。由于柱陣列的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),相比于8 m的柱長,該串聯(lián)芯片組可以在較低的流體壓力(25 MPa)下以0.60 mm/s的線速度完成分離。

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