摘 要 現(xiàn)有細(xì)菌定量檢測(cè)多依賴專業(yè)實(shí)驗(yàn)室,檢測(cè)周期較長(zhǎng)。 針對(duì)此問題,本研究基于微流控芯片液滴數(shù)字化分析,建立了一種細(xì)菌定量檢測(cè)方法。 采用具有平行液滴分析單元的微流控芯片,其特點(diǎn)在于使用了注射器真空驅(qū)動(dòng)液滴產(chǎn)生方法。 借助刃天青顯色反應(yīng)引起的熒光強(qiáng)度改變,可指示液滴內(nèi)活性細(xì)菌的存在。 通過計(jì)算細(xì)菌陽性液滴的比例,采用泊松分布算法,計(jì)算出原始樣品中的細(xì)菌密度。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,本方法可在3. 5 h 內(nèi)完成細(xì)菌定量分析,動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍為 105~ 108 CFU/ mL,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)低于5% 。 本方法具有操作簡(jiǎn)便和分析速度快的優(yōu)勢(shì),有望廣泛用于細(xì)菌快速定量檢測(cè)。

細(xì)菌定量檢測(cè)對(duì)于食品安全、環(huán)境監(jiān)測(cè)和疾病診斷均具有重要作用。 由于細(xì)菌定量檢測(cè)經(jīng)常在資源有限的情況下進(jìn)行,而且對(duì)于檢測(cè)時(shí)間要求很高,因此需要簡(jiǎn)便快速的檢測(cè)方法。 目前,用于細(xì)菌定量檢測(cè)的方法主要包括培養(yǎng)計(jì)數(shù)法、熒光定量分析 PCR、流式細(xì)胞術(shù)等,以及一些基于新型生物傳感器的檢測(cè)方法。 這些技術(shù)仍存在一定的局限性,如檢測(cè)周期較長(zhǎng)、操作步驟繁瑣、依賴于大型設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員。 因此,迫切需要建立操作簡(jiǎn)便、分析快速的細(xì)菌定量檢測(cè)方法。

液滴數(shù)字化分析是近年發(fā)展起來的一種高精度定量分析方法。 液滴數(shù)字化分析的原理是利用液滴技術(shù)將待測(cè)靶標(biāo)隨機(jī)分配到大量相互獨(dú)立的微滴中,每個(gè)液滴中最多含有一個(gè)靶細(xì)胞,每個(gè)微滴相當(dāng)于一個(gè)獨(dú)立的微反應(yīng)器; 繼而針對(duì)待測(cè)靶標(biāo)在微液滴中的直接或間接信號(hào),區(qū)分陽性和陰性液滴。 陽性微滴判讀為 1,陰性微滴判讀為 0,可根據(jù)泊松分布原理進(jìn)行計(jì)算,實(shí)現(xiàn)待測(cè)靶標(biāo)的絕對(duì)定量分析。 與傳統(tǒng)的分析技術(shù)相比,液滴數(shù)字化分析最突出的特點(diǎn)是其具有不依賴標(biāo)準(zhǔn)品的絕對(duì)定量分析能力。 此外,基于大規(guī)模液滴分散體系的數(shù)字化分析在檢測(cè)靈敏度和定量分析精度等方面也顯著優(yōu)于傳統(tǒng)定量分析方法。 鑒于微流控技術(shù)是大規(guī)模液滴操控的有利工具,微流控芯片成為數(shù)字化液滴分析的主要平臺(tái)。

自液滴數(shù)字化分析提出以來,此技術(shù)被廣泛用于多種類型的定量生物分析中, 包括核酸、蛋白和細(xì)胞分析,以及數(shù)字化細(xì)菌分析。 得益于微液滴對(duì)于反應(yīng)信號(hào)的相對(duì)富集作用,以及數(shù)字化分析方法的高檢測(cè)精度,數(shù)字化細(xì)菌分析在分析時(shí)間和定量分析精度等方面均顯著優(yōu)于傳統(tǒng)的細(xì)菌定量分析。 Boedicker 等利用阿爾瑪藍(lán)指示細(xì)菌活性,結(jié)合液滴數(shù)字化分析技術(shù),最快可在 2 h 內(nèi)檢測(cè)出樣品中的活性細(xì)菌,并且能夠在 7 h 內(nèi)獲得細(xì)菌的耐藥性信息。 Kang 等結(jié)合 DNA 酶?jìng)鞲衅髋c液滴數(shù)字化分析技術(shù),能夠在 3 h 內(nèi)得到血液樣品中的細(xì)菌定量分析信息,其實(shí)際密度與理論值的相關(guān)性良好(R2= 0. 999),測(cè)定下限達(dá)到 1 CFU/ mL。 Kaushik 等結(jié)合刃天青顯色原理與液滴數(shù)字化分析技術(shù),將細(xì)菌與顯色體系限制在約 20 pL 的液滴中,能夠在1 h內(nèi)得到細(xì)菌的耐藥性信息。Scheler等用含綠色熒光蛋白的大腸桿菌驗(yàn)證了液滴數(shù)字化分析的定量分析能力,與平板計(jì)數(shù)法結(jié)果的相關(guān)性良好(R2= 0. 9964),結(jié)合刃天青顯色法原理,在 3 ~ 4 h 得到樣品中細(xì)菌的耐藥性信息。

液滴數(shù)字化分析不依賴標(biāo)準(zhǔn)品的絕對(duì)定量分析能力,以及在靈敏度和定量分析精度方面的優(yōu)勢(shì),非常有利于現(xiàn)場(chǎng)快速細(xì)菌檢測(cè),然而,此技術(shù)在該領(lǐng)域的應(yīng)用還鮮有報(bào)道。 其主要原因在于微流控芯片上的液滴發(fā)生多依賴基于氣壓或注射泵等流體驅(qū)動(dòng)裝置, 這類裝置體積較大且操作繁瑣,難以應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。 相比較而言,正壓驅(qū)動(dòng)液滴發(fā)生方式使用廣泛,文獻(xiàn)已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了基于負(fù)壓的液滴發(fā)生方法。 在負(fù)壓驅(qū)動(dòng)的液滴發(fā)生體系中,僅需要一個(gè)簡(jiǎn)單的注射器即可驅(qū)動(dòng)油水兩相液體流動(dòng),并發(fā)生液滴。 這種液滴發(fā)生方法操作簡(jiǎn)便,無需復(fù)雜結(jié)構(gòu)流體控制設(shè)備,因而有望將液滴數(shù)字化細(xì)菌分析拓展到現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)領(lǐng)域。

微流控芯片技術(shù)在生物樣品分析中得到廣泛的應(yīng)用。 本研究基于負(fù)壓驅(qū)動(dòng)液滴微流控芯片,建立了一種細(xì)菌定量檢測(cè)方法。 采用具有平行液滴分析單元的微流控芯片,其特點(diǎn)在于使用了注射器真空驅(qū)動(dòng)的流動(dòng)聚焦式液滴發(fā)生方法。 利用單個(gè)注射器,即可實(shí)現(xiàn)多個(gè)分析單元中的快速平行液滴發(fā)生和捕獲。 以大腸桿菌為模式分析對(duì)象,借助刃天青顯色反應(yīng),實(shí)現(xiàn)數(shù)字化液滴細(xì)菌定量分析。 依據(jù)顯色反應(yīng)陽性液滴的比例,使用泊松分布原理計(jì)算原始樣品中的大腸桿菌密度。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,本方法具有操作簡(jiǎn)便和分析速度快的優(yōu)勢(shì),有望用于細(xì)菌的現(xiàn)場(chǎng)快速定量檢測(cè)。

微流控芯片

微流控芯片包含具有圖形化結(jié)構(gòu)的PDMS頂層和無結(jié)構(gòu)的玻璃底層(圖 1)。PDMS 層包含一組6個(gè)輻射狀排列分析單元,匯聚于同一出口,即負(fù)壓施加點(diǎn)。 每個(gè)單元包括上游的液滴發(fā)生器以及下游的液滴儲(chǔ)存池。 PDMS層使用標(biāo)準(zhǔn)光刻-倒模工藝加工,等離子處理后,與玻璃底層封接。加工完成的芯片經(jīng)紫外線照射 1 h,并于使用之前保存 1周。與芯片連接的特氟龍毛細(xì)管經(jīng)高壓消毒后保存?zhèn)溆谩?/span>

圖1 微流控芯片示意圖

液滴數(shù)字化顯色分析 液滴數(shù)字化顯色分析流程如圖 2 所示,具體操作如下:(1)使用特氟龍毛細(xì)管將注射器與芯片出口連接,將樣品溶液和油相溶液分別加載到芯片的樣品池和油相池; (2)拉動(dòng)注射器針柄,利用注射器真空產(chǎn)生的負(fù)壓驅(qū)動(dòng)油相和水相溶液流動(dòng),引發(fā)液滴發(fā)生。

圖 2 微流控芯片液滴數(shù)字化細(xì)菌分析流程示意圖

注射器真空驅(qū)動(dòng)的液滴發(fā)生

在注射器真空作用下,液滴分析單元的末端壓力接近于 0,而入口端液面壓力為 1 個(gè)大氣壓,這種壓力差存在于每個(gè)分析單元。 因此,利用一個(gè)注射器可實(shí)現(xiàn)多個(gè)分析單元內(nèi)的同步液滴發(fā)生。 在大氣壓驅(qū)動(dòng)下,水相和油相共同進(jìn)入芯片通道。 在十字型通道結(jié)構(gòu)液滴發(fā)生器處,油相剪切力作用于水相,因而將水相切割為液滴。 液滴的尺寸由液滴發(fā)生器處通道尺寸以及油相和水相的流速?zèng)Q定。 對(duì)于本實(shí)驗(yàn)中,液滴發(fā)生器十字型通道的尺寸為:水相孔徑20 滋m,油相孔徑175μm,深度40μm。 在注射器真空驅(qū)動(dòng)下,6個(gè)平行單元的液滴發(fā)生頻率介于 180 ~ 193 Hz 之間,生成的液滴可在 3 min內(nèi)充滿液滴收集池。 成像分析(圖3)顯示,收集池內(nèi)液滴變化范圍介于 25. 69 ~ 33. 01μm 之間,每個(gè)單元內(nèi)的液滴體積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)<2% ,均符合正態(tài)分布(p>0. 05)。 由此可見,這種注射器真空驅(qū)動(dòng)發(fā)生的液滴均一性較好,滿足數(shù)字化分析要求。 不同分析單元的液滴體積偏差的原因是單元內(nèi)流動(dòng)阻力的細(xì)微差異造成的流速差異。 由于液滴數(shù)字化分析引入了體積校正,不同單元內(nèi)液滴體積的偏差并不影響定量分析結(jié)果。

液滴反應(yīng)體系的穩(wěn)定性

PDMS 材質(zhì)芯片在長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)中存在水分遷移問題。 如圖 4 所示,原生 PDMS 芯片中的液滴在連續(xù)培養(yǎng)中體積持續(xù)降低,3 h 內(nèi)液滴體積可減少 95% 以上,提示存在水相-油相鄄PDMS 的水蒸汽遷移途徑。本研究從兩個(gè)方面采取措施,有效控制水分遷移問題:一是芯片底層采用密閉的玻璃材料,部分降低蒸發(fā)效應(yīng); 二是在PDMS頂層覆蓋礦物油,降低蒸發(fā)。 如圖 4 所示,在優(yōu)化的芯片反應(yīng)條件下,37℃ 孵育3 h 后,液滴體積只降低了13. 54%依 5. 65% ; 孵育 6 h 后,液滴體積也只降低了20. 79%依4. 68% 。

實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)了油鄄水界面成分串?dāng)_問題。 在使用7500氟化油、十六烷和石蠟油的液滴體系中,均發(fā)現(xiàn)細(xì)菌穿梭于油鄄水界面(圖 5)以及液滴內(nèi)刃天青的油相擴(kuò)散(圖6),明顯影響了液滴顯色實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和靈敏度。這些現(xiàn)象的產(chǎn)生可能是由于油-水界面的屏蔽作用不足。本研究通過調(diào)整表面活性劑濃度改善液滴穩(wěn)定性。 結(jié)果表明,即使增加表面活性劑濃度,也不能完全消除7500氟化油、十六烷液滴體系存在的成分串?dāng)_,但添加3% ABIL EM90 的石蠟油則可完全杜絕此問題。這是因?yàn)橥獗砻婊钚詣┰鰪?qiáng)了油-水界面的穩(wěn)定性,同時(shí)石蠟油具有較高的粘度,遏制了細(xì)菌游出。

圖 3  6個(gè)單元內(nèi)液滴的體積分布圖

液滴內(nèi)的細(xì)菌指示顯色反應(yīng)

液滴細(xì)菌顯色反應(yīng)以刃天為指示劑。 刃天青指示細(xì)菌活性的原理是:在活性細(xì)菌的多種還原酶作用下,無熒光的刃天青轉(zhuǎn)變?yōu)橛袩晒獾脑圎u靈。 鑒于液滴內(nèi)細(xì)菌數(shù)量對(duì)于顯色反應(yīng)信號(hào)強(qiáng)度的影響,顯色反應(yīng)條件的優(yōu)化均使用單細(xì)菌分散體系。本研究借助Syto 9染色,確定了適宜的輸入細(xì)菌密度為1. 5*10⁶ CFU/ mL。在此輸入密度下,理論上,100%的液滴內(nèi)細(xì)菌數(shù)≤1,即每個(gè)液滴最多包裹1個(gè)細(xì)菌。

圖 4 優(yōu)化的芯片反應(yīng)條件抑制液滴內(nèi)水分遷移

測(cè)定了刃天青顯色信噪比相對(duì)孵育時(shí)間的變化,由圖 7A 可見,培養(yǎng) 2 h 后,開始出現(xiàn)顯著區(qū)別于噪聲的熒光(+)信號(hào)。 根據(jù)圖7A的結(jié)果分析培養(yǎng)5 h的陽性液滴數(shù)量穩(wěn)定時(shí)間,如圖7B所示,3. 5 h后,陽性液滴數(shù)不再增加,因此,后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用3. 5 h作為反應(yīng)終點(diǎn)時(shí)間。 相較于傳統(tǒng)試管方法12 h左右的顯色反應(yīng)時(shí)間,液滴顯色反應(yīng)所需時(shí)間大幅縮短,這得益于液滴分散對(duì)于樣品和顯色信號(hào)的相對(duì)富集效應(yīng)。在液滴分散體系內(nèi)只有部分液滴內(nèi)包裹細(xì)菌,相應(yīng)地液滴顯色反應(yīng)結(jié)果表現(xiàn)為“全冶或“無冶的形式,而宏觀反應(yīng)體系呈現(xiàn)的是平均反應(yīng)強(qiáng)度。 對(duì)于包裹細(xì)菌的液滴,液滴內(nèi)細(xì)菌密度較宏觀體系提高。例如,直徑30μm的液滴中包含單個(gè)細(xì)菌情況下,液滴內(nèi)細(xì)菌密度約為 9*10⁶ CFU/ mL,其密度相對(duì)于 10⁶ CFU/ mL 密度的細(xì)菌懸液提升9倍,而相對(duì)于10⁵ CFU/ mL 的細(xì)菌懸液提升了90倍。 由于液滴的封閉效應(yīng),液滴內(nèi)的顯色信號(hào)快速蓄積,因而可在較短時(shí)間內(nèi)達(dá)到檢測(cè)限。 由于不同種類細(xì)菌存在代謝活性差異,這種液滴數(shù)字化顯色分析方法的普適性需要通過測(cè)試更多種類細(xì)菌進(jìn)行驗(yàn)證。

圖 5 不同油相條件下液滴的細(xì)菌屏蔽作用比較

為了驗(yàn)證液滴刃天青顯色方法對(duì)于細(xì)菌的特異性指示效果,借助圖像指示,在1個(gè)液滴細(xì)菌分散體系內(nèi)隨機(jī)抽取100個(gè)不含菌的液滴和100個(gè)含活性菌液滴,使用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)分析了兩組液滴內(nèi)熒光強(qiáng)度的差異。 結(jié)果表明,兩組細(xì)菌的顯色信號(hào)具有顯著性差異( p<0. 05),提示液滴刃天青顯色法可特異性指示活性細(xì)菌。

建立了一種基于微流控液滴數(shù)字化顯色分析的細(xì)菌快速定量分析方法。 利用注射器真空發(fā)生液滴,操作簡(jiǎn)便可靠; 芯片采用平行分析單元設(shè)計(jì),可提供適宜的測(cè)試通量。 本方法定量分析精度高,定量分析RSD低于5% ; 分析時(shí)間短,可在3. 5 h內(nèi)獲得細(xì)菌定量分析信息。 上述特點(diǎn)使得這種細(xì)菌定量分析方法非常適用于資源有限條件下的細(xì)菌快速檢測(cè)。

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