基于液滴模式的微流控細(xì)胞篩選系統(tǒng)

自2001年Quake研究組提出液滴微流控的概念以來(lái),液滴微流控技術(shù)得到了長(zhǎng)足發(fā)展,在高通量藥物篩選領(lǐng)域也得到了廣泛應(yīng)用?；谝旱文Ｊ降奈⒘骺叵到y(tǒng)利用互不相溶的兩相形成pL至nL級(jí)包裹細(xì)胞的液滴,在液滴中完成細(xì)胞的培養(yǎng)和對(duì)細(xì)胞的藥物刺激等操作。這類系統(tǒng)可以在短時(shí)間內(nèi)形成大量細(xì)胞液滴,提高實(shí)驗(yàn)的通量,并可有效降低試劑的消耗量,但液滴反應(yīng)器的使用同時(shí)也對(duì)液滴內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的更新和細(xì)胞代謝物的清理提出了挑戰(zhàn)。

Clausell-Tormos等首次建立了可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)的液滴微流控系統(tǒng),以添加了表面活性劑的氟油(FC40)為連續(xù)相(continuous phase),細(xì)胞懸浮液為分散相(dispersed phase),生成了FC40包裹的細(xì)胞液滴。FC40具有良好的生物兼容性和透氣性,因此能夠使得細(xì)胞在液滴中正常生長(zhǎng)。該研究組分別以白血病T細(xì)胞(jurkat)和腎細(xì)胞(HEK293T)作為懸液細(xì)胞和貼壁細(xì)胞的代表,證明了即使在液滴體積僅為660 pL的條件下,3 d后細(xì)胞的存活率仍能達(dá)到80%。

除了產(chǎn)生大小均一的液滴,能夠?qū)σ旱芜M(jìn)行精準(zhǔn)操控是實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分析的必要條件。Brouzes等構(gòu)建了一種集成化的液滴微流控系統(tǒng),用于高通量單細(xì)胞藥物篩選(見(jiàn)圖4a)。首先利用光學(xué)編碼技術(shù)對(duì)不同的藥物液滴進(jìn)行標(biāo)記,形成化合物庫(kù),再在電場(chǎng)的作用下將藥物液滴和單細(xì)胞液滴順序融合、收集,孵育24 h后將其重新注入微流控芯片中,并將其與含有細(xì)胞活性分析試劑的液滴再次融合,對(duì)藥物刺激結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)分析。Kulesa等同樣利用電場(chǎng)融合液滴的方法設(shè)計(jì)了一套適用于組合藥物篩選的微流控芯片系統(tǒng)。在該系統(tǒng)中,細(xì)胞懸浮液、不同的藥物溶液和特異性熒光染料被預(yù)先混合并乳化為液滴,這種熒光染料能夠分別在不同的激發(fā)光下實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物的識(shí)別和細(xì)胞活性的檢測(cè)。之后將得到的液滴注入PDMS微坑芯片中,由于微坑的獨(dú)特結(jié)構(gòu),每個(gè)微坑能夠同時(shí)捕獲兩個(gè)液滴,兩個(gè)隨機(jī)被捕獲的液滴在電場(chǎng)作用下融合,進(jìn)行藥物對(duì)細(xì)胞的刺激實(shí)驗(yàn)(見(jiàn)圖4b)。利用該系統(tǒng)評(píng)估了4000多種藥物與10種抗生素對(duì)大腸桿菌(Escherichia coli)的聯(lián)合作用,成功發(fā)現(xiàn)了多種之前未被報(bào)道的協(xié)同組合。Wong等設(shè)計(jì)了一種PDMS通道芯片,用于形成細(xì)胞液滴進(jìn)行藥物篩選(見(jiàn)圖4c)。

圖 4   基于液滴模式的微流控細(xì)胞篩選系統(tǒng)

每個(gè)單通道包含48個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)腔室,當(dāng)細(xì)胞樣品從通道入口流入時(shí),由于腔室(well)之后通道(restriction)的限制壓力,流體只能進(jìn)入腔室區(qū)域和旁路通道(bypass);隨后再通入油相,由于腔室之前通道(neck)的限制壓力,油相無(wú)法進(jìn)入腔室,從而截?cái)嗔黧w,即可依次在腔室中形成細(xì)胞液滴。在該系統(tǒng)中,一個(gè)通道中平均截留80000個(gè)細(xì)胞,用以篩選5種藥物作用條件,對(duì)于貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞均可適用,可實(shí)現(xiàn)在腫瘤切除24 h內(nèi),快速、低成本地篩查原發(fā)性腫瘤癌細(xì)胞。

為了更好地模擬體內(nèi)腫瘤細(xì)胞,目前已經(jīng)發(fā)展了多種基于3D細(xì)胞培養(yǎng)的液滴微流控系統(tǒng)。Wang等將HeLa細(xì)胞包裹在由藻酸鹽和基質(zhì)膠混合得到的水凝膠液滴中,形成細(xì)胞球(見(jiàn)圖5a),之后使用長(zhǎng)春新堿(vincristine)對(duì)細(xì)胞球進(jìn)行刺激。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,相比于傳統(tǒng)單層培養(yǎng)的細(xì)胞,腫瘤細(xì)胞球具有更明顯的耐藥性。Sun等開(kāi)發(fā)了一種生成具有核-殼結(jié)構(gòu)的藻酸鹽微粒的方法,之后將乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)和成纖維細(xì)胞(human mammary fibroblasts)分別封裝在藻酸鹽微粒的核與殼中,建立3D共培養(yǎng)的腫瘤模型,模擬體內(nèi)微小的腫瘤組織(見(jiàn)圖5b)。利用該共培養(yǎng)腫瘤球體測(cè)定了姜黃素和紫杉醇(paclitaxel)兩種抗癌藥物的細(xì)胞毒性,顯示出與常規(guī)孔板方法結(jié)果相似的腫瘤球耐藥性。該方法可快速形成大小一致但組成不同的各種腫瘤球體,應(yīng)用于大規(guī)模抗腫瘤藥物的篩選,同時(shí)也為細(xì)胞的共培養(yǎng)模式提供了新思路。作者所在研究組發(fā)展了一種在PDMS基片的側(cè)壁上形成細(xì)胞球的方法,通過(guò)序控液滴陣列(SODA)技術(shù)控制毛細(xì)管探針在基片側(cè)壁依次形成細(xì)胞懸液的懸滴,并穩(wěn)定地附著在側(cè)壁上,最終培養(yǎng)形成了HepG2細(xì)胞球,并完成了阿霉素對(duì)細(xì)胞球的刺激實(shí)驗(yàn)(見(jiàn)圖5c)。這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于不僅可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的3D培養(yǎng),還使得懸滴的上方和下方均處于開(kāi)放的狀態(tài),可以方便地完成后續(xù)的藥物加入、細(xì)胞染色以及細(xì)胞觀察等操作。

圖 5   基于3D細(xì)胞培養(yǎng)的液滴模式微流控細(xì)胞篩選系統(tǒng)

基于微陣列模式的微流控細(xì)胞篩選系統(tǒng)

基于微陣列模式的微流控細(xì)胞篩選系統(tǒng)是指在能夠適應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)的載體上,通過(guò)一定的手段生成細(xì)胞液滴陣列,并對(duì)細(xì)胞液滴陣列進(jìn)行操控和分析。這類系統(tǒng)能夠通過(guò)擴(kuò)大液滴陣列的規(guī)模在單次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)篩選大量不同的樣品,而且容易實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞液滴陣列的整體操控以提高篩選效率,但同時(shí)這些操作的實(shí)現(xiàn)也依賴于高精度且配套的液體操控設(shè)備。

Lee等構(gòu)建了一種名為水凝膠液滴陣列(DataChip)的微陣列芯片系統(tǒng)(見(jiàn)圖6a),并應(yīng)用于高通量藥物篩選實(shí)驗(yàn)中。首先利用凝膠打印機(jī)在經(jīng)過(guò)處理的玻璃表面生成含有乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)的水凝膠液滴陣列進(jìn)行孵育培養(yǎng),然后將預(yù)先制備的藥物凝膠陣列(MetaChip)貼合于細(xì)胞凝膠陣列上完成藥物刺激實(shí)驗(yàn)。該系統(tǒng)最多可集成1080個(gè)不同條件的液滴陣列,藥篩結(jié)果與傳統(tǒng)的基于96孔板的方法所得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近,但藥物消耗量可以降低約2000倍。之后該研究組還提出了通過(guò)在微柱陣列芯片的微柱上形成水凝膠細(xì)胞液滴用于藥物篩選的方法。

圖 6   基于微陣列模式的微流控細(xì)胞篩選系統(tǒng)

微坑陣列因?yàn)橐子诩庸?、通量?/span>,在形成細(xì)胞液滴陣列上應(yīng)用非常廣泛。Wu等[68]利用聚乙二醇(PEG)微坑陣列芯片和PDMS微柱陣列芯片構(gòu)建了一種夾心結(jié)構(gòu)的微流控細(xì)胞篩選系統(tǒng)(見(jiàn)圖6b)。先通過(guò)點(diǎn)樣儀將不同的藥物沉積在PDMS微柱陣列上,之后插入接種了細(xì)胞的PEG微坑中,實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的藥物刺激。盡管該微坑/微柱陣列芯片僅為普通載玻片大小,但單次可完成2100個(gè)測(cè)定。利用該系統(tǒng)測(cè)試了320種天然化合物對(duì)乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)的化學(xué)毒性,還進(jìn)行了P-糖蛋白(P-glycoprotein)與天然化合物的組合檢測(cè),成功篩選出能夠增強(qiáng)對(duì)MCF-7細(xì)胞抑制作用的組合。Li等設(shè)計(jì)了類似的微坑/微柱結(jié)構(gòu)裝置。直接以1536孔板提供微坑,制備互補(bǔ)的PDMS微柱,并將其連接到1536孔板的板蓋上,加藥時(shí)翻轉(zhuǎn)板蓋對(duì)準(zhǔn)孔板使微柱插入孔中。通過(guò)熒光檢測(cè)藥物與乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231)的相互作用,獲得了抑制MDA-MB-231細(xì)胞活性的先導(dǎo)單一藥物以及具有協(xié)同作用的藥物組合。Chong等設(shè)計(jì)了一種由同心細(xì)胞腔室單元組成的微坑陣列芯片,用于細(xì)胞的共培養(yǎng)(見(jiàn)圖6c)。每個(gè)同心細(xì)胞腔室單元由中心腔室和環(huán)形腔室組成。肝細(xì)胞球體(HepaRG)和U937免疫細(xì)胞分別被接種在中心腔室和環(huán)形腔室中,經(jīng)過(guò)肝代謝后的活性代謝物通過(guò)腔室之間的微通道擴(kuò)散至鄰近的免疫腔室中。通過(guò)檢測(cè)免疫細(xì)胞的活化程度,測(cè)試了3種藥物的致敏性,表明了與傳統(tǒng)細(xì)胞遷移腔室(Transwell)培養(yǎng)方式相比,該芯片可以更好地區(qū)分皮膚過(guò)敏的致敏藥物和非致敏藥物。

利用表面張力來(lái)形成細(xì)胞液滴陣列也是常用的一種方法。通常會(huì)選擇對(duì)芯片表面進(jìn)行選擇性修飾,改變芯片表面特定區(qū)域的親疏水性質(zhì),使得細(xì)胞懸液被截留在特定區(qū)域,從而形成細(xì)胞液滴陣列。Popova等開(kāi)發(fā)了一種形成超疏水-超親水微圖案的方法。利用超疏水和超親水區(qū)域的潤(rùn)濕性差別,自發(fā)地形成細(xì)胞液滴陣列(見(jiàn)圖6d)。通過(guò)在這些獨(dú)立的液滴中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),再加入不同的藥物試劑,實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的高通量分析。Zhang等制備了一種由PDMS微坑陣列和超疏水聚合物層組成的超疏水微坑陣列芯片。除了能用來(lái)接種細(xì)胞液滴,還可以快速實(shí)現(xiàn)整個(gè)液滴陣列的培養(yǎng)基更換,因此該系統(tǒng)兼容于貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞。

作者所在研究組也將SODA技術(shù)應(yīng)用于構(gòu)建細(xì)胞液滴陣列中,發(fā)展了一種基于細(xì)胞液滴微陣列的藥物篩選系統(tǒng)。得益于SODA技術(shù)對(duì)液體的靈活操控能力(包括液體的量取、吸取、轉(zhuǎn)移、注射、混合等),該系統(tǒng)在一塊PDMS芯片上完成了藥物篩選過(guò)程所需要的全部操作步驟,包括細(xì)胞接種、第一個(gè)藥物刺激、第二個(gè)藥物刺激、細(xì)胞熒光標(biāo)記等。采用每24 h更換一次細(xì)胞液滴培養(yǎng)基的方法,在覆蓋了氟油(FC40)的500 nL液滴中完成了長(zhǎng)達(dá)11 d的細(xì)胞培養(yǎng)。該系統(tǒng)被應(yīng)用于3種抗癌藥物黃酮哌啶醇(flavopiridol)、紫杉醇和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)對(duì)A549細(xì)胞的藥物聯(lián)用組合篩選中(見(jiàn)圖6e),得到了產(chǎn)生最佳抑制效率的藥物組合。

總結(jié)與展望

高通量藥物篩選是現(xiàn)階段藥物開(kāi)發(fā)的主要途徑。微流控技術(shù)的出現(xiàn)使生化反應(yīng)可以在微加工的通道、腔室或nL級(jí)甚至是pL級(jí)的液滴中進(jìn)行,這在很大程度上改變了傳統(tǒng)高通量篩選系統(tǒng)的工作模式,引起了人們的廣泛關(guān)注,使得基于微流控技術(shù)的細(xì)胞篩選系統(tǒng)得到了快速發(fā)展,展現(xiàn)出突出的研究潛力和應(yīng)用價(jià)值。

盡管微流控技術(shù)在試劑消耗、篩選通量、細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境控制等方面與常規(guī)方法相比已經(jīng)展現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì),但仍然有很大的發(fā)展空間。目前文獻(xiàn)報(bào)道的大部分微流控細(xì)胞水平高通量藥物篩選系統(tǒng)仍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段,尚未達(dá)到商品化和通用化的程度。多數(shù)系統(tǒng)還難以在超微量和高通量水平下,完成從細(xì)胞陣列的形成、培養(yǎng)到加藥和檢測(cè)等全過(guò)程操作的自動(dòng)化。如何自動(dòng)實(shí)現(xiàn)有限細(xì)胞的精準(zhǔn)量取與分配,如何精準(zhǔn)地控制批量微反應(yīng)器內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)條件,如何自動(dòng)實(shí)現(xiàn)大規(guī)模具有不同組成和濃度藥物的加入和刺激,以及如何自動(dòng)實(shí)現(xiàn)篩選結(jié)果的快速高通量檢測(cè)等,是下一步在實(shí)現(xiàn)微流控細(xì)胞水平高通量藥物篩選系統(tǒng)實(shí)用化中應(yīng)該重點(diǎn)解決的問(wèn)題。此外,目前的微流控系統(tǒng)構(gòu)建的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境與實(shí)際體內(nèi)細(xì)胞的微環(huán)境還有較大差距。為了能夠提高藥物篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性,目前研究者們已經(jīng)不局限于傳統(tǒng)獨(dú)立細(xì)胞的培養(yǎng)模型,而是通過(guò)構(gòu)建各種不同結(jié)構(gòu)的器官芯片來(lái)進(jìn)一步模擬人體組織和器官的功能,包括實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的共培養(yǎng)、血液的流動(dòng)以及物質(zhì)的傳輸?shù)?以此來(lái)提供一個(gè)更加接近人體真實(shí)生理和病理?xiàng)l件的研究模型,這也將是今后該領(lǐng)域的重點(diǎn)發(fā)展方向之一。

總之,微流控藥物篩選系統(tǒng)發(fā)展的最終目的是為了減少藥物開(kāi)發(fā)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的需求,甚至是部分替代動(dòng)物實(shí)驗(yàn),以促進(jìn)更大規(guī)模、更高通量,同時(shí)更安全、更有效的藥物開(kāi)發(fā)。雖然這還有很長(zhǎng)的道路要走,但隨著微流控技術(shù)的快速發(fā)展,微流控細(xì)胞水平的高通量藥物篩選系統(tǒng)一定會(huì)得到進(jìn)一步完善,實(shí)現(xiàn)更為強(qiáng)大和復(fù)雜的功能,成為推進(jìn)全自動(dòng)藥物開(kāi)發(fā)的重要力量。

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