隨著技術(shù)的進(jìn)步,外泌體檢測(cè)的各種方法不斷涌現(xiàn),前面介紹的方法往往需要相對(duì)龐大和復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)設(shè)施。近年來(lái),微流控技術(shù)高速發(fā)展,許多基于微流控技術(shù)的外泌體檢測(cè)方法不斷被報(bào)道,這些檢測(cè)方法具有分析速度快、靈敏度高、試劑消耗少、攜帶方便等優(yōu)點(diǎn)。此外,微流控技術(shù)易于模塊化并可多單元集成,這意味著可以將外泌體的純化、富集和檢測(cè)整合到微流控平臺(tái)上,為臨床發(fā)現(xiàn)外泌體生物標(biāo)志物和對(duì)腫瘤等疾病的診斷與預(yù)后提供巨大的潛力。目前基于微流控的外泌體分析方法大致可以分為:熒光檢測(cè)、表面等離子體共振、核磁共振、數(shù)字液滴PCR、電化學(xué)傳感等,下面將對(duì)提到的這幾種方法進(jìn)行詳細(xì)的介紹。

4.1 熒光檢測(cè)

熒光是一種物質(zhì)在吸收光照或者其他電磁輻射后出現(xiàn)冷發(fā)光的現(xiàn)象。其熒光強(qiáng)度、波長(zhǎng)、發(fā)光時(shí)間與材料的性質(zhì)有關(guān)。因此,觀測(cè)熒光的發(fā)射參數(shù)可以用來(lái)檢測(cè)目標(biāo)樣品。熒光成像技術(shù)具有精度高、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn),已廣泛應(yīng)用于微流控芯片的外泌體檢測(cè)系統(tǒng)中。近期的研究報(bào)道中,Ai等建立了一種微流控水動(dòng)力分析平臺(tái),該平臺(tái)首先利用微珠對(duì)溶液中的外泌體進(jìn)行初步的捕獲,然后利用微流控芯片將富集有外泌體的微珠進(jìn)行分散與固定,在芯片上實(shí)現(xiàn)了外泌體的大規(guī)模多重?zé)晒夥治?見(jiàn)圖6a)。

而Hansford等則構(gòu)建了一種經(jīng)過(guò)抗體功能化的人字形溝槽微流控裝置,在實(shí)驗(yàn)中,研究人員將其用于高級(jí)別漿液性卵巢癌病人血清中外泌體的分析,利用熒光顯微鏡對(duì)微流控芯片捕獲和釋放的外泌體進(jìn)行表征,從而實(shí)現(xiàn)了外泌體的洗脫過(guò)程的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)(見(jiàn)圖6b)。流式細(xì)胞術(shù)(FCM)和微流控技術(shù)相結(jié)合在外泌體檢測(cè)方面也有很大的潛力。一種基于微流控技術(shù)的多功能流式細(xì)胞儀成像檢測(cè)系統(tǒng)已被用于卵巢癌的早期檢測(cè),該方法通過(guò)建立由平行納米通道組成的流式細(xì)胞術(shù)陣列,成功地實(shí)現(xiàn)了外泌體的計(jì)數(shù)。從發(fā)展趨勢(shì)來(lái)看,基于微流控芯片的熒光檢測(cè)方法在外泌體檢測(cè)中的應(yīng)用將會(huì)越來(lái)越廣泛。

4.2 表面等離子體共振

表面等離子體共振(SPR)是一種無(wú)標(biāo)簽的實(shí)時(shí)跟蹤傳感技術(shù),通過(guò)分子吸附在金屬表面引起的折射率改變實(shí)現(xiàn)對(duì)生物分子的痕量分析。近年來(lái),基于SPR技術(shù)的納米傳感器因其在分子檢測(cè)上的高靈敏性而備受關(guān)注。Hu等開(kāi)發(fā)了一種基于SPR的外泌體微流控芯片傳感器,實(shí)驗(yàn)中該團(tuán)隊(duì)將抗體修飾在金的表面,在利用抗體微陣列捕獲外泌體后,金表面的折射率發(fā)生改變,實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液中的外泌體的定量檢測(cè),為外泌體的分離分析提供了一種簡(jiǎn)便、高效的策略。

4.3 核磁共振

核磁共振現(xiàn)象(nuclear magnetic resonance, NMR)是一種基于磁矩不為零的原子核在外磁場(chǎng)作用下自旋能級(jí)發(fā)生塞曼分裂,共振吸收某一定頻率的射頻輻射的物理過(guò)程,由Purcell和Bloch在1946年發(fā)現(xiàn)。NMR是化學(xué)分析中的一項(xiàng)重要技術(shù),Lee等將用于NMR測(cè)量的微線圈嵌入到微流控芯片的中間層,用抗體和外泌體作用后與磁性納米顆粒進(jìn)行偶聯(lián),使用內(nèi)置微線圈進(jìn)行核磁共振測(cè)量,以確定樣品的R2值,實(shí)現(xiàn)了對(duì)外泌體膜蛋白的檢測(cè)。

圖6   微流控芯片與熒光檢測(cè)聯(lián)用用于外泌體檢測(cè)

4.4 數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)(dPCR)是一種絕對(duì)定量的方法,它將含有核酸模板的標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系,平均分配成上萬(wàn)個(gè)和數(shù)百萬(wàn)個(gè)PCR反應(yīng),使每個(gè)反應(yīng)中盡可能含有一個(gè)模板分子,在單分子水平上進(jìn)行大規(guī)模的平行PCR分析。dPCR檢測(cè)目標(biāo)基因更可靠,不需要校準(zhǔn)曲線。由于其高靈敏度,dPCR已廣泛應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域,包括單細(xì)胞分析、突變檢測(cè)、拷貝數(shù)變異分析、細(xì)菌和病毒檢測(cè)等?？梢栽O(shè)想,隨著微尺度樣品處理與dPCR分析的集成,該技術(shù)將成為臨床樣本中外泌體基因分析的有力工具。

4.5 電化學(xué)傳感

電化學(xué)分析方法因其具有成本低、時(shí)效性好、靈敏度高、樣品量少等優(yōu)點(diǎn)在生化檢測(cè)領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。在電化學(xué)檢測(cè)過(guò)程中,將識(shí)別元件(如抗體、適配體等)修飾到化學(xué)電極上與外泌體特異性結(jié)合,再利用不同的電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)(包括伏安法、安培法、阻抗法、電位法等)對(duì)電極進(jìn)行檢測(cè)便可以獲取樣品中外泌體的濃度和表面蛋白等信息。Revzin等報(bào)道了一種基于適配體的電化學(xué)生物傳感器用于外泌體的定量檢測(cè):將外泌體跨膜蛋白CD63適配體固定在金電極表面上與含有亞甲基藍(lán)標(biāo)記的探針鏈雜交,當(dāng)檢測(cè)到外泌體時(shí),探針鏈會(huì)釋放出來(lái),電化學(xué)信號(hào)以與分析物濃度成正比的方式降低;將該裝置整合到微流控芯片中,可以對(duì)外泌體濃度在1×106~1×108個(gè)粒子/mL的樣本進(jìn)行定量檢測(cè)。Ye等則以聚二甲基硅氧烷為主要材料,構(gòu)建了內(nèi)部含有人字形微陣列結(jié)構(gòu)的電化學(xué)檢測(cè)芯片(見(jiàn)圖7),當(dāng)檢測(cè)到外泌體跨膜蛋白CD63時(shí),吸附有外泌體的磁珠可與一種DNA發(fā)卡結(jié)構(gòu)結(jié)合,在血清素的作用下,發(fā)卡結(jié)構(gòu)異構(gòu)成G-四聚體結(jié)構(gòu),對(duì)過(guò)氧化氫分解具有高效的催化作用,而產(chǎn)生強(qiáng)烈的電化學(xué)信號(hào),從而實(shí)現(xiàn)對(duì)外泌體的檢測(cè);在對(duì)臨床血清樣品中CD63陽(yáng)性外泌體定量檢測(cè)中,文中開(kāi)發(fā)的兩步級(jí)聯(lián)微流控平臺(tái),可以實(shí)現(xiàn)對(duì)健康組和疾病組的外泌體含量的靈敏區(qū)分。

免責(zé)聲明：文章來(lái)源DOI: 10.3724/SP.J.1123.2021.07005  以傳播知識(shí)、有益學(xué)習(xí)和研究為宗旨。 轉(zhuǎn)載僅供參考學(xué)習(xí)及傳遞有用信息，版權(quán)歸原作者所有，如侵犯權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)系刪除。