1.3 流體控制

芯片色譜是以微流控芯片作為載體的色譜系統(tǒng),其核心-微流控芯片的關(guān)鍵功能就在于流體控制。高效的微流體控制是芯片色譜正常工作的基礎(chǔ)。進(jìn)樣是色譜分析極為重要的一個步驟。進(jìn)樣量過大會導(dǎo)致進(jìn)樣時間過長、色譜柱過載、峰展寬等問題,嚴(yán)重影響色譜分離的效率。目前與高效液相色譜配套的進(jìn)樣針的規(guī)格普遍在微升級別,而芯片色譜平臺需要控制納升級別的進(jìn)樣量。因此,開發(fā)與芯片色譜相匹配的進(jìn)樣系統(tǒng)顯得十分重要。芯片色譜進(jìn)樣技術(shù)大致可分為電動進(jìn)樣與壓力進(jìn)樣兩類。其中,電動進(jìn)樣無需泵閥結(jié)構(gòu)、操作簡單的特點使其成為最早投入使用的方法(T型和雙T型電動進(jìn)樣通道),同時也是目前最常用的芯片色譜進(jìn)樣模式。Cong等開發(fā)了一種電動閥門式的芯片色譜進(jìn)樣結(jié)構(gòu)(見圖3a)。這種結(jié)構(gòu)中有一個電驅(qū)動的可變型閥門,閥門兩側(cè)分別是進(jìn)樣通道和色譜柱。在準(zhǔn)備階段,在樣品通道與色譜通道兩端施加電壓,樣品先進(jìn)入樣品通道,并由于閥門阻擋無法進(jìn)入色譜柱。在進(jìn)樣階段,閥門脈沖開關(guān)打開,樣品定量進(jìn)入色譜通道,之后閥門關(guān)閉并開始色譜分離。電動進(jìn)樣由于擴散、遷移率等問題,通常進(jìn)樣誤差很大,很難做到定量進(jìn)樣。相對的,基于機械手段推動樣品的壓力進(jìn)樣方式可以實現(xiàn)高精度的定量進(jìn)樣。但由于需要對流體額外施加壓力,壓力進(jìn)樣需要更多泵閥結(jié)構(gòu)提供支持。壓力進(jìn)樣也可以通過分流的操作方式擺脫泵閥結(jié)構(gòu),從而實現(xiàn)簡單的定量進(jìn)樣。Gáspár等在PDMS芯片上設(shè)計了一種分流進(jìn)樣結(jié)構(gòu),由進(jìn)樣口注入分流區(qū)的樣品會依據(jù)分流結(jié)構(gòu)各通道的寬度比進(jìn)行分流。通過控制進(jìn)入色譜柱的通道與其他分流通道的比例就可以將進(jìn)樣量精確地控制在納升級。但需要指出,分流式壓力進(jìn)樣需要較大的樣品量,且不可避免地會造成樣品浪費。Ha等開發(fā)了一種特殊的“穿刺”進(jìn)樣方法,他們直接將微升級的進(jìn)樣針扎入PDMS芯片的通道中,之后用千分尺調(diào)節(jié)進(jìn)樣針筒活塞位置實現(xiàn)“穿刺進(jìn)樣”。由于千分尺精確的距離調(diào)節(jié),這種進(jìn)樣方式可實現(xiàn)3 nL體積的精準(zhǔn)可重復(fù)進(jìn)樣,且非常廉價、使用簡單。

圖 3   芯片色譜流體控制措施

芯片色譜泵可簡單分為芯片外置泵和芯片內(nèi)置泵。早期芯片色譜泵直接沿用高效液相色譜設(shè)備使用的常規(guī)高壓泵。但由于芯片通道尺寸減小,這些常規(guī)泵在進(jìn)行梯度分離時會發(fā)生嚴(yán)重的梯度滯后現(xiàn)象。因此,常規(guī)泵需要加入分流裝置來調(diào)整流速,以適應(yīng)芯片色譜的工作條件。但分流在梯度分離中會造成嚴(yán)重的溶劑浪費,因此芯片色譜需要與其匹配的低流速高壓泵系統(tǒng)。在芯片外置泵中,能夠同時實現(xiàn)低流速和高壓力的最簡單的泵類型就是注射泵。Grinias等通過閥門切換梯度儲存流路與UPLC泵和氣動放大泵的連接實現(xiàn)了一種高壓注射泵結(jié)構(gòu)。在準(zhǔn)備階段,常規(guī)UPLC泵與梯度儲存流路相連,配制好的流動相被注入梯度儲存流路并保存在其中。在色譜分離階段,切換閥門使裝載有流動相的梯度儲存流路與色譜柱相連,啟動與梯度儲存流路相連的氣動泵,使儲存的流動相以一個較高的壓力注入色譜柱中完成分離。這一泵結(jié)構(gòu)可以達(dá)到300 MPa的運行壓力。芯片內(nèi)置泵的驅(qū)動方式以電驅(qū)動、電滲流和磁驅(qū)動為主,雖然也存在芯片內(nèi)置機械泵,但蠕動泵、氣動泵結(jié)構(gòu)在芯片上的加工難度較高,應(yīng)用實例很少。最具代表性的芯片內(nèi)置泵是電滲泵(electroosmotic pumps, EOP)。EOP有如下幾點優(yōu)勢:

(1) 可直接集成到微流控芯片上;

(2) 可生成無脈沖液流;

(3) 可快速改變液流大小和方向;

(4) 沒有運動組件,可有效提高泵的穩(wěn)定性和壽命;

(5) 在較大的背壓范圍內(nèi)都可產(chǎn)生中低流速液流。

Wang等開發(fā)了一種高壓EOP芯片,該芯片泵的工作壓力約17 MPa,工作流速約為500 nL/min,該條件已足以支持芯片液相色譜的運行。該芯片由大量EOP基本單元組成,每個EOP基本單元由數(shù)個電滲通道并聯(lián)而成。每個基本單元再與其他單元串聯(lián)成整個EOP芯片,芯片泵可產(chǎn)生的液流壓力直接正比于芯片內(nèi)含的EOP基本單元數(shù)量。

液滴技術(shù)作為一種新型的微流體控制技術(shù)也被應(yīng)用到了芯片色譜上。Gerhardt等將液滴微流控技術(shù)與HPLC芯片無縫組合(見圖3b),在HPLC芯片色譜柱出口處耦合T型液滴生成通道。利用與色譜通道正交的油相切割水相色譜洗脫物,將洗脫物以45 Hz的頻率切割為大量體積約1 nL的液滴。靜態(tài)液滴內(nèi)流體為層流狀態(tài),具有低擴散、無返混的特點。因此將色譜洗脫物切割為液滴的過程,相當(dāng)于將色譜分離的色譜圖譜切割成大量片段并進(jìn)行保存,防止洗脫物返混合污染,最大限度地保留了分離分辨率。這一利用液滴保存色譜結(jié)果的技術(shù)也為洗脫物在柱后進(jìn)一步的處理與分析提供了時間和空間條件。

1.4 檢測器

相較于常規(guī)色譜,芯片色譜需要更加靈敏、響應(yīng)更快的檢測器。芯片色譜常用的檢測器可分為光學(xué)檢測器、電化學(xué)檢測器、質(zhì)譜檢測器3類。紫外-可見光譜法是分析化學(xué)中應(yīng)用最為廣泛的光學(xué)檢測手段,其簡單的結(jié)構(gòu)使其在芯片色譜中有著廣泛的應(yīng)用。但芯片通道尺寸相較常規(guī)色譜柱徑的大幅度縮小,使得芯片色譜通道的光程大幅縮小。這極大影響了紫外-可見光譜在芯片色譜上原位檢測的靈敏度(尤其是當(dāng)通道寬度小于100 μm時)。因此,在芯片色譜上進(jìn)行紫外-可見光譜檢測需要通過增大通道寬度或添加微結(jié)構(gòu)(如光纖、波導(dǎo)管)等手段來增加光程,以提高檢測靈敏度。相比之下,熒光光譜的發(fā)射光強度與激發(fā)光強度成正相關(guān),在使用激光這樣的強光源作為激發(fā)光源時(激光誘導(dǎo)熒光光譜,LIF),光程的減小對熒光光譜檢測靈敏度的影響幾乎可以忽略。熒光光譜主要局限于可自發(fā)熒光的物種有限,目前需要借助熒光標(biāo)記和熒光染料才能做到廣泛應(yīng)用。TPE熒光光譜利用兩個光子同時激發(fā)一個分子,可使分子達(dá)到更高的能級,從而讓一些原本不會發(fā)出熒光的分子產(chǎn)生熒光信號,該技術(shù)有望實現(xiàn)無標(biāo)記的廣泛熒光檢測。Hackl等將電色譜芯片與TPE熒光光譜聯(lián)用(見圖4a),實現(xiàn)了芯片色譜平臺上的無標(biāo)記時間分辨熒光光譜檢測。該芯片對多環(huán)芳烴的檢測靈敏度達(dá)到了nmol級。他們同時還證明了532 nm的TPE熒光光譜可以達(dá)到與266 nm單光子激發(fā)(one-photon excitation, OPE)熒光光譜相近的靈敏度。這意味著雙光子激發(fā)熒光光譜可在聚合物芯片等具有一定紫外吸收能力、但更容易制作的芯片平臺上使用,而無標(biāo)記單光子激發(fā)熒光光譜則需要使用石英等低紫外吸收的芯片材料來保證檢測靈敏度。除了紫外-可見光譜、熒光光譜外,拉曼光譜、表面增強拉曼光譜也被嘗試應(yīng)用于芯片色譜檢測器,并表現(xiàn)出可期的前景。

電化學(xué)檢測器是通過檢測電極表面電化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的電信號(電流、電壓)來進(jìn)行分析檢測的手段。用于電化學(xué)檢測的電極可以很容易地進(jìn)行微型化,并集成到微流控芯片平臺上。而且,電化學(xué)檢測的工作站已經(jīng)可以做到小型化便攜式,因此電化學(xué)檢測方法也被視為實現(xiàn)便攜式芯片色譜的重要手段。電化學(xué)檢測方法在芯片色譜中的應(yīng)用有一個限制因素:電極的使用壽命有限,需要經(jīng)常更換;常見的微流控芯片在封裝后就無法再拆開,因此電極損壞后檢測芯片就只能報廢處理。Erkal等為解決這一問題,開發(fā)了一種3D打印的電化學(xué)檢測芯片。這種芯片在電極位置加工了螺紋結(jié)構(gòu)用于可替換電極的固定;同時螺紋結(jié)構(gòu)還滿足了芯片的密封需求,使得芯片多次更換電極也不會漏液。相比于常規(guī)電導(dǎo)、電勢檢測需要的電極與溶液直接接觸,電容耦合非接觸電導(dǎo)檢測(capacitively coupled contactless conductivity detection, C4D)不需要與待測溶液直接接觸,且電導(dǎo)檢測靈敏度極高,其作為微流控芯片檢測器更具潛力。Beutner等設(shè)計了一種C4D與質(zhì)譜聯(lián)用的檢測方法,用于毛細(xì)管電泳分析檢測酚類物質(zhì)。他們發(fā)現(xiàn)這兩種檢測方法具有較好的互補性:C4D檢測器對間甲酚具有極佳的靈敏度而對硝基酚敏感性不佳,而質(zhì)譜檢測器則正好相反。

圖 4   部分芯片色譜檢測器

質(zhì)譜法是基于不同質(zhì)荷比的離子在電場加速后進(jìn)入磁場中運動軌跡的不同,或在真空中飛行時間的不同,進(jìn)行物質(zhì)鑒定的檢測方法。質(zhì)譜法的質(zhì)量分辨本領(lǐng)使其具有極高的靈敏度和分辨率,以及超快的分析速度,同時還能提供豐富的分析信息。相比于光學(xué)檢測器和電化學(xué)檢測器,質(zhì)譜檢測器顯然是三者之中結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜,成本最為昂貴的檢測器。但由于質(zhì)譜法極高的靈敏度、微型化色譜與質(zhì)譜極好的相容性以及質(zhì)譜在組學(xué)研究中的重要地位,芯片色譜與質(zhì)譜的聯(lián)用仍然是前沿的研究方向。芯片色譜與質(zhì)譜聯(lián)用需要解決色譜出口與質(zhì)譜離子源之間的耦合問題。目前常用的芯片色譜-質(zhì)譜聯(lián)用離子源是ESI和基質(zhì)輔助激光解吸電離離子源。ESI離子源因其廣泛的應(yīng)用性和高靈敏度而成為與芯片色譜耦合最理想的離子源。Lotter等對玻璃芯片的ESI噴口進(jìn)行了較為系統(tǒng)的探究。他們研究了4類ESI噴口形狀對質(zhì)譜檢測效果的影響(見圖4b),發(fā)現(xiàn)在高流速(約400 nL/min)條件下4種芯片噴口沒有明顯的區(qū)別。但是在低流速(<50 nL/min)條件下,尖銳的ESI噴口(pulled和ground型)產(chǎn)生的電噴霧更加穩(wěn)定,離子化效果更好。加工芯片ESI噴口需要較為精密的加工技術(shù),一種更為簡單的噴口構(gòu)建方法是在芯片柱上嵌入一段拉尖毛細(xì)管作為ESI噴口。Dietze等在制作聚合物芯片時,在通道中嵌入一段一端燒蝕拉尖的毛細(xì)管,成功與ESI源耦合。這種利用毛細(xì)管針尖制作噴口的方法特別適合于聚合物這類無法直接作為ESI噴嘴的芯片基底材料。MALDI離子源應(yīng)用于微流控芯片上,可分為在線離子源和離線離子源兩類。人們已報道了數(shù)類微流控MALDI芯片,但帶有色譜分離功能的芯片色譜-MALDI-MS較少。Lazar等開發(fā)了一種新型的液相色譜-MALDI-MS芯片(見圖4c),該芯片以C18顆粒填料作為色譜固定相,在色譜柱通道的正交方向制作了大量與色譜柱通道相通的MALDI收集通道。在進(jìn)樣并完成色譜分離后,洗脫物不再由色譜柱軸向洗脫,而是通過與MALDI收集通道相連的電滲泵結(jié)構(gòu)橫向泵入MALDI儲液槽中,直接進(jìn)行MALDI-MS檢測。由于MALDI收集通道被集成在色譜柱通道側(cè)向,進(jìn)行洗脫物收集時相當(dāng)于對色譜圖進(jìn)行了切割和分段檢測,這使得該系統(tǒng)可以獲得優(yōu)良的分辨率和檢測通量。

3 總結(jié)與展望

從歷史上第一個芯片色譜裝置誕生至今已近30年,但芯片色譜技術(shù)仍基本停留在基礎(chǔ)研究和科研實驗室里。相較于最初的期待,芯片色譜走向產(chǎn)業(yè)化的推進(jìn)速度顯得些許緩慢。目前存在的主要瓶頸在于:芯片色譜技術(shù)對微型化、集成化的需求與芯片材料、工藝和設(shè)計發(fā)展現(xiàn)狀的矛盾。微流控芯片微型化、集成化主要通過縮小通道尺寸和增加通道總長度實現(xiàn)。對微納尺度流體,通道尺寸的縮小和長度的增加都會大幅增加流體阻力?，F(xiàn)有的芯片基底材料承壓能力普遍在60 MPa以下,材料性質(zhì)限制了色譜芯片微型化和集成化的進(jìn)一步提升。這一瓶頸的解決在于發(fā)展新型的芯片基底材料,尤其是高強度和優(yōu)良加工性的聚合物材料;同時也需要產(chǎn)業(yè)界形成相對統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的流體通道基本結(jié)構(gòu)設(shè)計,以提高材料性能的利用度。此外,與芯片色譜匹配的外部設(shè)備微型化程度低,芯片接口技術(shù)尚不成熟,以及芯片色譜產(chǎn)業(yè)缺乏統(tǒng)一行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)等,都有待學(xué)術(shù)界與產(chǎn)業(yè)界共同努力解決。但客觀地看,色譜微型化的趨勢已經(jīng)十分明顯:毛細(xì)管色譜的產(chǎn)業(yè)化、微流甚至納流色譜的推廣及其在生物醫(yī)學(xué)分析中應(yīng)用已日漸增多。作為色譜微型化另一途徑的芯片色譜,正式走向?qū)嶋H應(yīng)用只是時間問題。芯片液相色譜極高的可擴展性、可集成性以及模塊化的優(yōu)勢使其最有可能成為色譜這項技術(shù)走入便攜檢測(POCT)領(lǐng)域的方式,但這一理想還有待進(jìn)一步提高芯片集成度和系統(tǒng)微型化程度才能真正實現(xiàn)。相信在不久的將來,“plug-and-play”的芯片色譜將成為現(xiàn)實。

免責(zé)聲明：文章來源DOI: 10.3724/SP.J.1123.2020.07031  以傳播知識、有益學(xué)習(xí)和研究為宗旨。 轉(zhuǎn)載僅供參考學(xué)習(xí)及傳遞有用信息，版權(quán)歸原作者所有，如侵犯權(quán)益，請聯(lián)系刪除。