2.3 電場流動分離技術(shù)

場流分離技術(shù)最早由Giddings等發(fā)明,是分析分離領(lǐng)域用來分離大分子膠體和顆粒材料的一種分離方法,隨著場流分離技術(shù)的不斷發(fā)展,其也逐漸成為色譜分離體系中一項重要的分離技術(shù)。其中電場場流分離技術(shù)被越來越多的研究學(xué)者使用,其分離原理是通過在分離通道的上下壁(電極)所施加的直流電場或交流電場,對混合帶電顆粒進(jìn)行精準(zhǔn)分離。該技術(shù)可以根據(jù)混合樣品的大小與帶電性質(zhì)的不同進(jìn)行分離和聚焦等處理,如圖1c所示。傳統(tǒng)的直流電場流分離技術(shù)是針對通道壁施加固定電壓,通道壁表面在直流電場條件下形成雙電層,降低通道內(nèi)有效電場,導(dǎo)致電場場流分離技術(shù)的分離效率大大降低。在交流電場流分離技術(shù)中,施加的交流電場根據(jù)頻率調(diào)節(jié)電場方向,減緩內(nèi)電極表面形成的雙電層,提高通道內(nèi)有效電場,起到提高分離效率的作用。目前電場場流分離技術(shù)可以對顆粒物、生物細(xì)胞和外泌體等進(jìn)行有效分離,被廣泛應(yīng)用于微納米顆粒和細(xì)胞分離等領(lǐng)域。Tasci等為了改善納米顆粒在交流電場場流分離中存在的小尺寸微納尺度物質(zhì)的擴(kuò)散現(xiàn)象,對電參數(shù)中的偏置電壓進(jìn)行調(diào)節(jié)。該團(tuán)隊使用高于50%的偏置電壓對50 nm以下顆粒物進(jìn)行有效分離,結(jié)果證明通過調(diào)節(jié)偏置電壓可以減小擴(kuò)散現(xiàn)象對分離納米顆粒的影響,提高分離效率。Petersen等利用交流電場場流分離技術(shù)對外泌體的分離進(jìn)行研究,以交流電壓為常量,流動相為變量的條件下對外泌體進(jìn)行了分離,證實交流電場流分離技術(shù)可以對外泌體進(jìn)行有效分離。

在電場場流分離技術(shù)中,電極容易產(chǎn)生電極極化的現(xiàn)象,限制了電場場流分離技術(shù)在微流控芯片中的應(yīng)用。對此,本課題組提出了微顆粒分離“靶式分布”新概念毛細(xì)管靶式電場流分離技術(shù),如圖4所示。利用離子液體及介孔硅材料界面修飾技術(shù)解決了電極極化的問題,實現(xiàn)了在環(huán)形通道中對微納尺度物質(zhì)的在線分離。通過微流控芯片模擬該體系下顆粒物的運(yùn)動情況,成功分離不同尺寸的聚苯乙烯顆粒物。該技術(shù)解決了傳統(tǒng)電場流分離領(lǐng)域中電極極化的問題,并提出了顆粒物的靶式分布和錐形排列新理念,在單細(xì)胞分離分析、外泌體分離等具有廣闊的應(yīng)用前景。

圖4   開管式毛細(xì)管電場流微分離技術(shù)原理示意圖

2.4 電滲分離

感應(yīng)電荷電滲是導(dǎo)體表面與電場相互作用產(chǎn)生的雙電層的擴(kuò)散層在切向電場作用下產(chǎn)生微旋渦的一種電化學(xué)效應(yīng)。在電場條件下電極表面發(fā)生極化現(xiàn)象形成雙電層,雙電層分為致密層與擴(kuò)散層,其中擴(kuò)散層在電場作用下發(fā)生移動,致密層中離子不動,進(jìn)而在電場內(nèi)形成渦旋,混合樣品中不同帶電特性的樣品將會隨著渦旋逐漸向懸浮電極中心移動,根據(jù)不同的運(yùn)動行為,達(dá)到分離作用,如圖1d所示?；贗CEO的顆粒分離方法具有可調(diào)節(jié)流型、操作方便、無接觸等優(yōu)點(diǎn)。

Chen等提出了一種利用誘導(dǎo)電荷電滲透在連續(xù)流體中分離顆粒的微流控芯片裝置,如圖5所示。利用ICEO產(chǎn)生渦旋成功對聚苯乙烯顆粒與二氧化硅微粒顆粒物進(jìn)行分離,分離效率在99%以上。ICEO對酵母細(xì)胞的純化回收率超過96%。感應(yīng)電荷電滲透技術(shù)在與微流控技術(shù)聯(lián)用后,可以針對不同樣品進(jìn)行聚焦、分離和純化等實驗,為今后生物、醫(yī)療和化學(xué)領(lǐng)域的微納尺度物質(zhì)分離提供一種有效技術(shù)支撐。

圖5   基于誘導(dǎo)電荷電滲透的微流控分離系統(tǒng)

綜上描述,電場分離技術(shù)的無標(biāo)記分離、高選擇性以及高效分離等特點(diǎn)和微流控裝置樣品量少、金屬污染少、樣品制備簡單等特性的結(jié)合大大提高了對生物細(xì)胞和微納米顆粒的精準(zhǔn)分離、捕獲及聚焦等效果。在微納尺度物質(zhì)分離領(lǐng)域中具有良好的應(yīng)用前景。

3 基于外加磁場的分離技術(shù)

近年來,利用外加磁場的作用操縱微顆粒、細(xì)胞等微納米尺度物質(zhì)分離分析逐漸被重視起來。磁場分離技術(shù)中磁性納米顆粒與目標(biāo)物可以簡單有效的結(jié)合,磁場條件下可以對包裹磁性納米顆粒的樣品實現(xiàn)溫和、無損和高通量的快速分離,因此在分離微納尺度物質(zhì)研究中成為最佳選擇之一。同時,在微流控體系下采用磁珠分離方法對微納尺度物質(zhì)進(jìn)行分離也已非常普遍。越來越多的研究學(xué)者將磁場分離技術(shù)與微流控技術(shù)進(jìn)行聯(lián)用,在微流控體系下的磁場分離技術(shù)利用磁性顆粒修飾的抗體或官能團(tuán),與所需的細(xì)胞或蛋白質(zhì)進(jìn)行特異性結(jié)合,在不同磁場條件下微流控連續(xù)分離裝置可以分離不同類型的微尺度混合物,利用磁場與微流控技術(shù)的耦合裝置可以分離磁性顆粒與非磁性顆粒,以及帶有不同性質(zhì)的磁性顆粒物。所以利用磁場分離技術(shù)與微流控裝置結(jié)構(gòu)進(jìn)行聯(lián)用受到國內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注。Kumar等開發(fā)了一種新型的微流控裝置,該裝置采用永磁體,在0.5~5 mL/h流速范圍內(nèi)研究了11個聚氰胺微粒子對薄微通道壁的無鞘液磁性聚焦。將順磁性粒子的混合物注入該裝置以演示其分選原理。兩種不同尺寸的混合磁粒子均沿通道壁排列,在設(shè)備前半段達(dá)到聚焦,不同尺寸大小目標(biāo)物位于不同的流線上,在進(jìn)入膨脹區(qū)域時,被分割成明顯的流線以達(dá)到分離的效果。通過磁場場流分離與微流控裝置的聯(lián)用,達(dá)到了高通量(10000 cells/s)和高純度(98%)的效果。該方法克服了傳統(tǒng)磁泳法操作復(fù)雜、準(zhǔn)備和操作時間長等局限性,將磁場分離技術(shù)與微流控技術(shù)進(jìn)行聯(lián)用,從而對不同尺寸、不同磁性的微納米顆粒和生物細(xì)胞進(jìn)行分離分析。

Pamme等利用特定的微流控裝置對磁性納米顆粒和非磁性納米顆粒進(jìn)行連續(xù)流動分離,如圖6a所示。通過將混合樣品注入裝置內(nèi)的分離室,顆粒物在受到垂直向上的磁力作用下,根據(jù)顆粒物自身磁化率和大小等性質(zhì)不同,在不同的層流方向上產(chǎn)生偏轉(zhuǎn)達(dá)到分離的效果。利用微流控分離通道設(shè)計性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn),可以根據(jù)混合樣品的磁性不同來調(diào)節(jié)磁鐵的具體位置,達(dá)到精確分離的效果,分離后的目標(biāo)物在微流控裝置的不同出口處流出,進(jìn)入到不同的緩沖層,在下游對其進(jìn)行多步生化處理,為后續(xù)實驗做準(zhǔn)備。

圖6   基于磁場的微流控分離系統(tǒng)

Malica等以食源性病原體引起的人體感染疾病問題作為出發(fā)點(diǎn),針對單核細(xì)胞增生李斯特菌引起的感染對衛(wèi)生安全構(gòu)成威脅等問題進(jìn)行研究,提出了利用磁性納米粒子對其進(jìn)行免疫磁分離。根據(jù)它可以有效對目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行捕獲的優(yōu)點(diǎn),與微流控技術(shù)耦合制作了一個磁場-微流控芯片裝置,如圖6b所示,該裝置的磁捕獲區(qū)由多個涂覆了軟鐵磁鎳的圓柱組成,可以產(chǎn)生強(qiáng)大可切換的三維磁陷阱,并利用數(shù)值和相關(guān)理論分析預(yù)測磁陷阱周圍的磁場分布,對磁標(biāo)記的細(xì)菌進(jìn)行高效磁捕獲和釋放,具有靈活、可定制、低成本等特點(diǎn),還可以針對各種微米以及亞微米級別目標(biāo)物分離捕獲,對MNPs的最大回收率為91%,活菌的最大捕獲效率為30%。該微流控裝置可以對食品安全細(xì)菌檢測提供技術(shù)支持。

Moser等提出了一種在芯片上捕獲蛋白質(zhì)的磁珠免疫凝集方法,如圖6c所示,該方法利用垂直在流動方向上的磁力,使磁性顆粒固定凝集在通道壁上,而磁場梯度的周期性翻轉(zhuǎn)和力場的變化使磁珠在通道內(nèi)不停地做循環(huán)運(yùn)動,形成更大的磁粒子動態(tài)塞,用來捕獲流動相中的目標(biāo)物,并用簡單的光學(xué)檢測方法確定免疫凝集的磁珠量以及濃度,為芯片上蛋白質(zhì)捕獲領(lǐng)域提供了一個更加有效的技術(shù)支持。

Ungerbock等對磁光傳感器粒子在微流控裝置中的實用性進(jìn)行了評價,如圖6d所示。MOSePs可以用于任何帶有光學(xué)透明微流控芯片的微觀氧氣成像、多重分析物的并行監(jiān)測和作為靈活的傳感器點(diǎn)監(jiān)測酶活性,當(dāng)無法集成傳感器層時,也可以在微流控結(jié)構(gòu)中形成固定傳感器點(diǎn)。以氧傳感器為例,Ungerbock等研究了不同直徑的MOSePs的積累特性以及在不同流速下原位傳感器的穩(wěn)定性,利用馬高列斯熒光黃色染料(MFY)和路瑪近紅色染料(LR)對磁光傳感粒子進(jìn)行染色,再從外部使用磁鐵裝置對其進(jìn)行分離。實驗結(jié)果證明,MoSePs作為微流控器件中的一部分,促進(jìn)發(fā)光傳感器領(lǐng)域的進(jìn)一步集成。

綜上所述,磁場的無標(biāo)記特性與微流控技術(shù)的聯(lián)用,在微流控芯片裝置內(nèi)部將微納尺度物質(zhì)根據(jù)自身性質(zhì)(大小、磁化率)的不同,實現(xiàn)對微納米顆粒的在線連續(xù)分離,達(dá)到對目標(biāo)樣品的快速、無損和高效分離和捕獲。

4 基于外加聲場的分離技術(shù)

在微納米尺度下如何實現(xiàn)微顆粒的精準(zhǔn)操縱一直是研究的熱門。研究發(fā)現(xiàn),施加外場的方式可以實現(xiàn)對微顆粒的操縱,其中運(yùn)用聲場的方式相較于其他外場來說所需能量更小,不會損壞細(xì)胞等微納尺度物質(zhì)活性和對樣品電性和磁性等無特殊要求,因此適用面更為廣泛。聲場分離技術(shù)是指在微流體系統(tǒng)中利用聲輻射力操縱懸浮液中的微納尺度物質(zhì)分離的一種技術(shù)。ARF的表現(xiàn)形式可以分為體聲波或表面聲波。SAW更容易通過增加頻率來調(diào)節(jié)粒子運(yùn)動速度,從而操縱粒子的運(yùn)動,甚至可以驅(qū)動流動相。另外,在1988年,Semyonov等首次提出聲場場流分離技術(shù)。它可以將液體內(nèi)部的膠體顆粒、蛋白質(zhì)和細(xì)胞等物質(zhì)進(jìn)行聚焦分離處理,利用聲輻射力作為驅(qū)動流動相中混合顆粒物的外力,根據(jù)混合樣品中各個微粒的大小、尺寸和密度等性質(zhì)所產(chǎn)生的運(yùn)動行為在微流控芯片裝置中起到分離作用,以及利用小尺寸顆粒物在流動相中的擴(kuò)散起到抑制的作用,達(dá)到精準(zhǔn)分離和聚焦的效果,目前廣泛應(yīng)用于細(xì)胞篩選、細(xì)胞捕獲和生物聚合物分離等。體聲波微流控芯片可以利用駐波的聲泳力來提高吞吐量,也可以對顆粒物進(jìn)行聚焦。這兩種方法具有細(xì)胞損害小、保持細(xì)胞完整性和裝置便捷的優(yōu)點(diǎn)。Hwang等研制了一種聲場場流分離裝置,在特定的微流控裝置的通道中,沿重力方向上釋放超聲波駐波并在通道底部形成一個壓力節(jié)點(diǎn)。同一方向的聲場力和重力對小尺寸混合顆粒物起到抑制擴(kuò)散的作用。通過熒光顯微鏡的檢測觀察,該微流控裝置成功對1.0、3.5和10 μm的混合熒光顆粒物進(jìn)行了有效分離。

Jakobsson等提出了一種利用超聲波駐波在微流控通道內(nèi)部對紅細(xì)胞進(jìn)行聚焦和控制的方法,如圖7a所示。紅細(xì)胞可以用來檢測生物細(xì)胞的生理狀態(tài),但是細(xì)胞在流動相中面向激光光源的橫截面位置不同,因此相同細(xì)胞所處不同的橫截面時可能檢測出不同的光散射測量值,所以控制紅細(xì)胞的定向能力對生物醫(yī)療分離是有必要的。該團(tuán)隊利用聲波對細(xì)胞無損害、靈敏性強(qiáng)的特點(diǎn)在微流控芯片中利用駐波聲場將紅細(xì)胞的橫截面最小的尺寸方向與聲場方向平行。結(jié)果表明,有87.8%±3.8%的紅細(xì)胞可以水平定向,有98.7%±0.3%的紅細(xì)胞可以垂直定向。該技術(shù)對快速發(fā)展的流式細(xì)胞計數(shù)和圖像細(xì)胞計數(shù)都有潛在貢獻(xiàn)。

圖7   基于聲場的微流控分離系統(tǒng)

Li等發(fā)現(xiàn)從癌癥患者的臨床樣品中篩選循環(huán)腫瘤細(xì)胞存在技術(shù)限制、吞吐量不足和缺乏設(shè)備長期穩(wěn)定性等問題,選擇利用聲場力無標(biāo)簽和無接觸分選的優(yōu)點(diǎn)并結(jié)合微流控裝置高吞吐量的優(yōu)勢制作了一種傾斜角站立表面聲波微流控裝置,如圖7b所示。該裝置可以在流速為20 μL/min的條件下將循環(huán)腫瘤細(xì)胞從白細(xì)胞中進(jìn)行有效分離,并且針對癌細(xì)胞的回收率可以達(dá)到83%~96%,白細(xì)胞的去除率達(dá)到99%。這種方法適用于分離和白細(xì)胞有顯著大小和密度差異的癌細(xì)胞,利用傾斜角度的駐表面聲波裝置對臨床樣本進(jìn)行高通量分離,從白細(xì)胞中分離罕見癌細(xì)胞的效率比以往技術(shù)具有更高的分離性能,并適用于細(xì)胞清洗、細(xì)胞同步、血液成分分離和細(xì)菌分離等。

Ahmed等制作了一種傾斜角度的表面聲波的無鞘液聚焦和連續(xù)流中的粒子分離裝置,如圖7c所示,利用兩個互相交叉?zhèn)鞲衅鳟a(chǎn)生與流動方向呈30°的高頻傾斜角度表面聲波,在不使用鞘液的條件下直接對粒子施加聲輻力,分別在194 MHz和136 MHz頻率下通過IDTs的激發(fā),粒子被連續(xù)聚焦在微通道壁面的一側(cè),在流速為83.3 mm/s下,taTSAW微流控裝置對4.8 μm和3.2 μm顆粒的樣品混合物聚焦并分離,分離純度高達(dá)99%。在兩個微流控通道出口處顆粒分離率分別為93%和100%。這種方法較其他分離技術(shù)相比,不需要額外的鞘層流來進(jìn)行聚焦處理,在生物和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價值。

聲場也可以對目標(biāo)物進(jìn)行聚焦處理,例如Liu等利用簡單低成本的環(huán)形壓電傳感器制作了一種有壓電環(huán)陣列組成的聲流控多孔板微流控裝置,用于在每個板中心快速富集微納尺度物質(zhì),如圖7d所示,在玻璃基板上的圓形駐波產(chǎn)生向內(nèi)的徑向聲流,誘使微納尺度物質(zhì)在聲場力的帶動下將每個孔中的微納尺度物質(zhì)進(jìn)行富集。實驗結(jié)果證實,在0.4~30 μm范圍內(nèi)均可進(jìn)行操縱且具有良好富集效果。具有低成本、低功耗、簡單和可控性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),可以在生物和醫(yī)療等領(lǐng)域成為強(qiáng)大的工具。

Shi等利用駐波表面聲波聚焦技術(shù)在軟光刻法制備的聚二甲基硅氧烷通道上進(jìn)行聚焦實驗。如圖7e所示,樣品在壓力驅(qū)動力作用下注入微流控通道內(nèi),受到兩組在懸浮液中相同且延相反方向傳播的表面聲波形成駐聲表面波(SSAWs),通過調(diào)節(jié)兩個IDT釋放的波長控制SSAWs的壓力節(jié)點(diǎn)和反壓力節(jié)點(diǎn)位置,進(jìn)而控制其在流體中的周期性壓力節(jié)點(diǎn)(最小壓力)和反正壓力節(jié)點(diǎn)(最大壓力),當(dāng)通道僅覆蓋一個壓力節(jié)點(diǎn)時,樣品受聲場影響在中心線處聚焦,由于不同尺寸顆粒物在通道內(nèi)的運(yùn)動距離不同,較大尺寸顆粒物比較小尺寸顆粒物有更大的橫向位移,該裝置對0.87 μm和4.17 μm的乳膠粒子在360 ms內(nèi)進(jìn)行了分離。該方法具有操作簡單、快速便捷等優(yōu)勢,幾乎可用于任何微粒的聚焦。

綜上所述,聲泳分離技術(shù)作為與生物樣品非接觸的分離方式,在分離生物細(xì)胞時具有不破壞生物樣品性的優(yōu)勢。將聲泳分離技術(shù)與微流控技術(shù)進(jìn)行聯(lián)用可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)聲泳技術(shù)裝置龐大、操作復(fù)雜和對尺寸差異較小的顆粒分辨率低等缺點(diǎn),從而達(dá)到高通量、無損害和操作簡單的分離效果,為單細(xì)胞分離和捕獲等領(lǐng)域提供重要的技術(shù)支持。

5 總結(jié)與展望

利用流動場、電場、磁場和聲場等主動場分離技術(shù)與微流控技術(shù)的聯(lián)用,可以提高在不同條件下對微納尺度物質(zhì)的分離與富集能力。本文綜述了4種外加場在微流控技術(shù)中的研究進(jìn)展以及在未來的發(fā)展趨勢,流場場流分離技術(shù)利用溫和分離的特性,成功對蛋白質(zhì)和DNA等物質(zhì)進(jìn)行分離,并與其他檢測器耦合,對不同樣品表征精細(xì)化和對生物細(xì)胞的分離具有重要意義。在基于電場分離的微流控技術(shù)中因物質(zhì)本身或外部環(huán)境影響使其具有帶電特性,所以基于電場的微流控技術(shù)應(yīng)用比較廣泛,且可實現(xiàn)對微納尺度物質(zhì)的無標(biāo)簽、高選擇性和高效分離;基于磁場的微流控技術(shù)對物質(zhì)本身磁性要求更為嚴(yán)格,且部分需要對目標(biāo)物進(jìn)行標(biāo)記,難以實現(xiàn)無損分離,因此對分離分析較為脆弱的生物細(xì)胞存在限制;將聲場和微流控技術(shù)聯(lián)用的裝置可以利用聲場力對細(xì)胞進(jìn)行精準(zhǔn)操控,實現(xiàn)目標(biāo)物無損傷、高通量、快速的分離。利用主動場分離技術(shù)選擇性好、分離度高等優(yōu)點(diǎn),結(jié)合微流控技術(shù)的具有微型化、集成化、成本低廉等優(yōu)勢,達(dá)到使復(fù)雜分析方案合理化,顯著減少樣品體積和試劑成本,在處理微量樣品時具有快速化學(xué)分析、高吞吐量和高分辨率的效果,對生物樣品的富集濃縮都有較大的研究前景和價值。從應(yīng)用方面來看,利用微流控芯片實現(xiàn)微納尺度物質(zhì)的分離是社會發(fā)展的必然趨勢,但由于外加場裝置普遍都需要復(fù)雜龐大的驅(qū)動裝置,所以實現(xiàn)整個系統(tǒng)的微型化、便捷化仍是迫切的應(yīng)用需求。隨著相關(guān)技術(shù)的不斷發(fā)展和進(jìn)步,未來將會真正實現(xiàn)微型化、集成化的微流控主動場分離技術(shù)應(yīng)用于癌細(xì)胞的篩選、癌癥的早期檢測、微尺度物質(zhì)的精準(zhǔn)分離等各個方面。

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