摘要: 數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)近年來(lái)發(fā)展迅速。與以實(shí)時(shí)熒光定量PCR為代表的傳統(tǒng)PCR技術(shù)相比，數(shù)字PCR技術(shù)顯著提高了定量分析的精確度和靈敏度。數(shù)字PCR的快速發(fā)展與近年來(lái)微流控技術(shù)在數(shù)字PCR技術(shù)中的廣泛應(yīng)用有著密切的聯(lián)系。早期的研究和商業(yè)化產(chǎn)品使用的是大規(guī)模集成流路微流控芯片，加工過(guò)程復(fù)雜且價(jià)格高昂。近年來(lái)，液滴微流控芯片被應(yīng)用到數(shù)字PCR技術(shù)中，它可以在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生102～107個(gè)微液滴，每一個(gè)微液滴都是最多只含有一個(gè)目的基因片段的PCR反應(yīng)器。PCR擴(kuò)增后，通過(guò)對(duì)單個(gè)微液滴的觀察計(jì)數(shù)，就可以獲得絕對(duì)定量的分析數(shù)據(jù)。本文綜述了不同種類的液滴微流控系統(tǒng)在數(shù)字PCR技術(shù)中的應(yīng)用，以及液滴數(shù)字PCR微流控芯片在生物、醫(yī)藥、環(huán)境等領(lǐng)域的應(yīng)用。

引言

早在1992年，已有學(xué)者提出了數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Digital PCR, dPCR)的概念，并且指出其在DNA的定量分析方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。但是初期的dPCR技術(shù)發(fā)展十分緩慢，這是由于如果使用傳統(tǒng)的96孔板或者384孔板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，需要數(shù)個(gè)多孔板同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，不僅操作復(fù)雜，且實(shí)驗(yàn)樣品和試劑的消耗量非常大。在當(dāng)時(shí)的條件下，研究者很難開(kāi)展數(shù)字PCR的研究。此外，在DNA定量研究方面，由于實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Real-time quantitative PCR, RT-qPCR)等技術(shù)的發(fā)展和廣泛應(yīng)用，也使得dPCR技術(shù)的發(fā)展緩慢。

隨著微流控技術(shù)的出現(xiàn)和近年來(lái)的高速發(fā)展，研究者嘗試將微流控技術(shù)與數(shù)字PCR技術(shù)結(jié)合起來(lái)。與微流控芯片結(jié)合后的dPCR技術(shù)的靈敏度和精確度有了很大提高，在單細(xì)胞研究、基因測(cè)序、醫(yī)學(xué)診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品安等領(lǐng)域得到了越來(lái)越多的應(yīng)用，展現(xiàn)出了廣泛的應(yīng)用潛力。近年來(lái)，還涌現(xiàn)出一批商業(yè)化的dPCR檢測(cè)設(shè)備。本文綜述了近年來(lái)dPCR技術(shù)及液滴微流控芯片的發(fā)展?fàn)顩r，并介紹了dPCR技術(shù)在醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)等領(lǐng)域的實(shí)際應(yīng)用情況。

dPCR原理

傳統(tǒng)的實(shí)時(shí)定量PCR以指數(shù)形式體現(xiàn)定量信息，而dPCR技術(shù)所能提供的DNA量化信息是以線性的數(shù)字化形式體現(xiàn)的。dPCR的原理如圖 1所示，將含有目標(biāo)基因、引物、聚合酶等的溶液稀釋后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要被分成102~107份不等的溶液(反應(yīng)單元)，每份溶液中至多只含有一個(gè)目的基因拷貝。這些溶液?jiǎn)卧?jīng)過(guò)與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相同的熱循環(huán)擴(kuò)增后，對(duì)每份溶液進(jìn)行檢測(cè)。如果含有目的基因，則計(jì)為“1”(陽(yáng)性反應(yīng))；不含有目的基因，則計(jì)為“0”(陰性反應(yīng))，這些代表陽(yáng)性反應(yīng)的數(shù)字“1”和代表陰性反應(yīng)的數(shù)字“0”類似于數(shù)字電路中的通和斷兩種狀態(tài)，這也是dPCR名稱的由來(lái)。最后通過(guò)對(duì)陽(yáng)性反應(yīng)的單元計(jì)數(shù)可以獲知擴(kuò)增之前目的基因的絕對(duì)數(shù)量。考慮到有可能出現(xiàn)擴(kuò)增前一個(gè)反應(yīng)單元里有兩個(gè)或以上目的基因的情況，使用泊松分布進(jìn)行校正可以進(jìn)一步增加對(duì)擴(kuò)增前目的基因計(jì)量的準(zhǔn)確度。

與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比，由于熱循環(huán)和熒光探針標(biāo)記等技術(shù)已經(jīng)較為成熟，dPCR主要的技術(shù)難點(diǎn)體現(xiàn)在對(duì)稀釋后的反應(yīng)溶液進(jìn)行大規(guī)模等分的技術(shù)上。在對(duì)稀釋后的溶液進(jìn)行等分方面，最初采用了96孔或384孔板的方法，但這種方法試劑消耗量巨大(每孔約5μL)，且可實(shí)現(xiàn)的反應(yīng)單元數(shù)量較少。后來(lái)盡管在反應(yīng)單元的數(shù)量上有所增加，如Shen等在玻璃基底加工了1280個(gè)反應(yīng)單元，但仍存在溶液等分不能自動(dòng)完成和反應(yīng)單元數(shù)量較少的問(wèn)題。直到微流控技術(shù)被應(yīng)用到dPCR領(lǐng)域后，反應(yīng)單元的數(shù)量才得到了爆發(fā)式的增長(zhǎng)。關(guān)于微流控技術(shù)在dPCR領(lǐng)域的應(yīng)用，本文后續(xù)部分會(huì)詳細(xì)介紹。

為了進(jìn)一步說(shuō)明dPCR技術(shù)的原理，圖 2顯示了dPCR技術(shù)在胎兒早期疾病診斷中的應(yīng)用。圖 2a是檢測(cè)過(guò)程中一組12塊多孔板中的1塊，具有765個(gè)反應(yīng)單元，每個(gè)反應(yīng)單元的容積為6 nL，含有目標(biāo)基因、引物、熒光探針等的反應(yīng)溶液通過(guò)微流控技術(shù)被均勻送入各個(gè)反應(yīng)單元中。經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后，由TaqMan探針標(biāo)記的含有目標(biāo)基因的反應(yīng)單元發(fā)出熒光，可以很容易地觀察到。經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)圖像處理，轉(zhuǎn)換為圖 2b所示的熱點(diǎn)圖(Heat map), 每個(gè)紅點(diǎn)代表一個(gè)含有目標(biāo)基因的反應(yīng)單元，通過(guò)熱點(diǎn)圖就可以準(zhǔn)確分析出目標(biāo)基因的數(shù)量。圖 2c是作為參考的dPCR的擴(kuò)增曲線，需要指出的是，dPCR對(duì)目標(biāo)基因的測(cè)量并不需要擴(kuò)增曲線的幫助，而在實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)中，對(duì)目標(biāo)基因擴(kuò)增數(shù)量的檢測(cè)直接依賴于與標(biāo)準(zhǔn)曲線的對(duì)比，由于標(biāo)準(zhǔn)曲線與實(shí)際樣品擴(kuò)增效率不同等原因，導(dǎo)致熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)的準(zhǔn)確度偏低。Hindson和Whale等對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)和dPCR技術(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)對(duì)比，結(jié)果表明，相比于實(shí)時(shí)熒光定量PCR，dPCR對(duì)目標(biāo)基因定量檢測(cè)的靈敏度、精度、檢測(cè)時(shí)間等方面有著非常顯著的優(yōu)勢(shì)。在檢測(cè)精度方面，dPCR與實(shí)時(shí)熒光PCR相比，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)顯著減小，測(cè)量精密度提高；在檢測(cè)時(shí)間方面，如果保持與熒光PCR相同的精度，dPCR的日檢測(cè)量增加了7倍。

早期的微流控技術(shù)與dPCR的結(jié)合應(yīng)用體現(xiàn)在以集成流路微流控芯片(Integrated fluid circuit, IFC)為基礎(chǔ)的dPCR技術(shù)。這種微流控芯片采用多層光刻技術(shù)加工而成，具有非常復(fù)雜的流路結(jié)構(gòu)以及氣動(dòng)的微泵與微閥，通過(guò)微泵和微閥將溶液送入反應(yīng)腔陣列，其加工過(guò)程復(fù)雜，成本非常高，且受到加工技術(shù)和成本的限制，IFC芯片可以實(shí)現(xiàn)的反應(yīng)單元數(shù)量一般不超過(guò)10000個(gè)。

近年來(lái)，液滴微流控技術(shù)的發(fā)展給dPCR帶來(lái)了新的發(fā)展機(jī)遇。采用液滴微流控技術(shù)，經(jīng)過(guò)高度稀釋的含有模板DNA和引物等的反應(yīng)溶液可以在微流控芯片中很容易地被分成102~107小液滴，每個(gè)體積只有納升甚至皮升的小液滴都是只含有最多一個(gè)目的基因的微型反應(yīng)器，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后，通過(guò)熒光檢測(cè)，可以很直觀地定量分析出原始溶液中目的基因的拷貝數(shù)量。

與IFC芯片相比，液滴微流控芯片的優(yōu)勢(shì)不止體現(xiàn)在反應(yīng)單元的數(shù)量，其最大優(yōu)勢(shì)在于成本方面：IFC芯片的加工采用接近納米尺度的多層光刻技術(shù)，成本非常高；而液滴微流控芯片大多只有一層結(jié)構(gòu)，且加工尺度在微米級(jí)，因此大大降低了芯片的加工成本(微流控芯片的加工成本占芯片總成本的大部分)，這對(duì)于dPCR技術(shù)的發(fā)展至關(guān)重要。

微流控系統(tǒng)中微液滴的產(chǎn)生方法

如前所述，微流控技術(shù)對(duì)于dPCR發(fā)展的貢獻(xiàn)主要在于可以大規(guī)模增加反應(yīng)單元的數(shù)量，通過(guò)微流控技術(shù)，高效精確地將樣本溶液分割為102~107份。微流控技術(shù)對(duì)樣本溶液的分割，最初是由氣動(dòng)微泵、微閥控制分割樣本溶液的IFC芯片，不僅結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，加工難度也較大，可以分割的份數(shù)也非常有限，單塊芯片的成本非常高。近年來(lái)，研究者開(kāi)始使用微流控系統(tǒng)產(chǎn)生大量微液滴的辦法實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本溶液的分割，每個(gè)產(chǎn)生的含有目的基因、探針和引物等的微液滴都可以作為一個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)單元進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而微滴產(chǎn)生的速度、數(shù)量、體積等均可以通過(guò)微流控系統(tǒng)精確控制。相比于IFC芯片，液滴微流控芯片的加工過(guò)程簡(jiǎn)單，成本低廉，代表了未來(lái)微流控與dPCR結(jié)合的發(fā)展方向。下面將結(jié)合微液滴在dPCR領(lǐng)域的應(yīng)用，簡(jiǎn)要介紹使用微流控系統(tǒng)產(chǎn)生及操控微液滴的技術(shù)。

通過(guò)微流控系統(tǒng)產(chǎn)生大量應(yīng)用于dPCR技術(shù)的微液滴，最常用的方法是乳化技術(shù)(Emulsion)，即兩種不相溶的液體混合時(shí)，一種液體會(huì)以微滴的形式分散在另一種溶液中。微流控芯片可以在微尺度上對(duì)一種溶液(分散相)在另外一種不相溶的溶液(連續(xù)相)中產(chǎn)生微液滴的過(guò)程進(jìn)行精確控制，繼而獲得大量體積在納升甚至皮升級(jí)，且大小均一的微液滴。

圖 3顯示了使用液滴dPCR技術(shù)對(duì)癌癥基因進(jìn)行篩選和測(cè)序的應(yīng)用研究。如圖 3所示，在一個(gè)T形(T-junction)的微通道中，黃色代表油，藍(lán)色代表包含引物、熒光探針以及目標(biāo)基因等的水溶液。由于兩種液體不相溶，在微通道的液體流動(dòng)過(guò)程中，油在微通道內(nèi)在向左側(cè)流動(dòng)的過(guò)程中對(duì)水溶液不斷進(jìn)行擠壓，作為分散相的水溶液在連續(xù)相油的不斷擠壓中被最終剪斷，形成了一個(gè)微液滴(本例中體積為2.5 nL)。分散后的微液滴含有至多一個(gè)目的基因以及引物、熒光探針等，分散后的液滴可以使用傳統(tǒng)的PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，由于油的阻隔，在擴(kuò)增過(guò)程中，每個(gè)微液滴都是一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的反應(yīng)單位。

除了圖 3所展示的T形微通道的液滴產(chǎn)生系統(tǒng)，類似的還有Y形、十字形等多種微通道結(jié)構(gòu)，都可以用于產(chǎn)生微液滴。除了乳化法之外，還可以采用流動(dòng)聚焦(Flow-focusing)等方法產(chǎn)生單/雙/多層包裹的微液滴。采用微流控技術(shù)產(chǎn)生微液滴的大小與微通道的尺寸及連續(xù)相和分散相的流速、粘度等都有直接關(guān)系?，F(xiàn)階段使用微流控技術(shù)可以產(chǎn)生的微液滴的體積范圍從0.05 pL到1 nL不等，對(duì)應(yīng)的微液滴直徑為5~120μm，實(shí)際應(yīng)用中可以靈活選擇。文獻(xiàn)中采用的是以油包水(W/O)方式產(chǎn)生的微液滴，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，同樣的微流控系統(tǒng)還可以產(chǎn)生水包油(O/W)的微液滴，甚至氣體包水(W/G)的微液滴。

在連續(xù)相液體的選擇方面，多采用礦物油(Mineral oil)，對(duì)微液滴形狀的保持和微液滴間的阻隔起到了重要作用，且對(duì)微液滴中參與PCR擴(kuò)增的生物大分子、酶等的活性和結(jié)構(gòu)沒(méi)有影響。為了增強(qiáng)液滴產(chǎn)生的穩(wěn)定性和控制分散相微液滴的大小，有的研究者在礦物油中加入了0.5%~3.0%的表面活性劑。在水或油中添加表面活性劑對(duì)微液滴的穩(wěn)定起到了重要作用，且未發(fā)現(xiàn)毒副作用。未來(lái)的研究中，可以通過(guò)改變微通道表面的物理化學(xué)性質(zhì)等方法(物理/化學(xué)修飾)，增加微流控系統(tǒng)產(chǎn)生微液滴的穩(wěn)定性，從而擺脫對(duì)價(jià)格昂貴的表面活性劑的依賴，減少對(duì)溶液的污染。

微流控芯片材料的選擇與其應(yīng)用環(huán)境有直接關(guān)系。目前，在dPCR領(lǐng)域，無(wú)論是IFC芯片，還是液滴微流控芯片，通常使用聚二甲基硅氧烷(PDMS)材質(zhì)的微流控芯片。PDMS具有良好的生物相容性和透氣性，且微加工性能良好，但在某些有機(jī)溶劑的作用下會(huì)發(fā)生溶解和變形。根據(jù)目前微流控技術(shù)發(fā)展的總體趨勢(shì)，未來(lái)非常有可能產(chǎn)生基于熱塑性塑料(如：PMMA、PS、PC等)，甚至紙基等低成本微流控dPCR芯片。

微液滴的高通量生成技術(shù)

液滴微流控芯片在dPCR領(lǐng)域的應(yīng)用是利用了液滴微流控系統(tǒng)可以迅速產(chǎn)生大量的微液滴的優(yōu)勢(shì)。近年來(lái)，在產(chǎn)生高通量微液滴的微流控芯片方面進(jìn)行了大量研究，目前，單一微液滴產(chǎn)生裝置的液滴產(chǎn)生速度可以高達(dá)10 kHz，如果將多塊微流控芯片并行使用，或者在一塊微流控芯片上加工數(shù)十到數(shù)百個(gè)微液滴產(chǎn)生裝置，還可以極大提升液滴的產(chǎn)生速度。Nisisako等在一塊圓形的玻璃基底上呈輻射狀排布了128個(gè)Y形微液滴產(chǎn)生器，每小時(shí)可產(chǎn)生1 L粒徑為96.4μm的微液滴。

圖 4展示了Holtze等制作的高速微液滴發(fā)生微流控芯片，芯片采用了軟光刻的方法，使用傳統(tǒng)紫外光刻技術(shù)對(duì)SU-8進(jìn)行曝光沖洗后，利用SU-8作為模具，對(duì)PDMS進(jìn)行倒模，最后將PDMS鍵合在玻璃片上制成微流控芯片。他們不僅在連續(xù)相的油中添加了表面活性劑，還在分散相的水中也添加了具有良好生物相容性的表面活性劑(PFPE-PEG共聚物)，從而極大提高了微液滴高速產(chǎn)生時(shí)的穩(wěn)定性，液滴的產(chǎn)生速度可以達(dá)到30 kHz(圖 4a)。從圖 4b可見(jiàn)，隨著微通道內(nèi)油流量上升，微液滴的產(chǎn)生速度也迅速上升，產(chǎn)生的微液滴的直徑隨之變小。為了驗(yàn)證PFPE-PEG共聚物作為表面活性劑的生物兼容性，在微液滴中進(jìn)行了質(zhì)粒DNA體外編譯β-Galactosidase酶的實(shí)驗(yàn)，獲得了滿意的效果。

值得注意的是，高通量的微液滴產(chǎn)生技術(shù)對(duì)微流控芯片系統(tǒng)以及擴(kuò)增后的液滴熒光檢測(cè)都提出了更高的要求。首先，產(chǎn)生高通量液滴的微流控芯片對(duì)反應(yīng)液體進(jìn)樣的穩(wěn)定性和連續(xù)性都提出了更高要求，這種情況下，反應(yīng)液體進(jìn)樣常需要通過(guò)價(jià)格高昂的恒壓泵實(shí)現(xiàn)。其次，高通量的液滴產(chǎn)生微流控系統(tǒng)對(duì)芯片的鍵合也提出了更高要求，內(nèi)部的高壓液體對(duì)芯片的鍵合強(qiáng)度要求更高。最后，對(duì)液滴的熒光檢測(cè)的速度方面也提出了更高要求，檢測(cè)系統(tǒng)不僅需要在極短時(shí)間內(nèi)對(duì)微流控芯片中按順序排布流動(dòng)的微液滴進(jìn)行熒光檢測(cè)，還需要高速的數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)能力。

 dPCR與液滴微流控芯片的結(jié)合和應(yīng)用

目前，基于液滴微流控芯片的dPCR(Droplet digital PCR, ddPCR)已被廣泛應(yīng)用于疾病檢測(cè)、基因診斷、基因測(cè)序、食品安全等多個(gè)領(lǐng)域。

在疾病檢測(cè)和基因診斷方面，Heredia等采用液滴dPCR技術(shù)對(duì)乳腺癌腫瘤細(xì)胞中的表皮生長(zhǎng)因子受體(HER2)的表達(dá)水平進(jìn)行了研究。與之前研究者的結(jié)果相比，采用dPCR顯著提高了對(duì)HER2表達(dá)水平的準(zhǔn)確度，為研究HER2表達(dá)水平與乳腺癌發(fā)病之間的關(guān)系提供了準(zhǔn)確數(shù)據(jù)。dPCR技術(shù)在疾病診斷領(lǐng)域的應(yīng)用遠(yuǎn)不止于乳腺癌領(lǐng)域，在肺癌、結(jié)腸癌等疾病的檢測(cè)領(lǐng)域，研究者也利用dPCR技術(shù)對(duì)其相應(yīng)的標(biāo)志物(如：EGFR、KRAS等)進(jìn)行了檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)了在基因水平上對(duì)疾病診斷的目的。利用dPCR技術(shù)的高靈敏度，還可以對(duì)微量的游離在血液中的腫瘤導(dǎo)致的CNAs進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于癌癥的早期診斷有著重要的意義。實(shí)驗(yàn)表明，利用dPCR技術(shù)，可以達(dá)到在106個(gè)野生型中檢測(cè)出一個(gè)突變基因的靈敏度。Contente-Cuomo等使用液滴dPCR對(duì)微量的游離在細(xì)胞外可作為癌癥標(biāo)志物的DNA片段進(jìn)行了檢測(cè)，驗(yàn)證了在血液的復(fù)雜背景中，利用dPCR技術(shù)對(duì)循環(huán)腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)的可行性。

在環(huán)境工程和食品安全領(lǐng)域，Bian等采用經(jīng)過(guò)油飽和處理的基于PDMS材料的微流控芯片，對(duì)飲用水中E. coliO157和L. monocytogenes兩種細(xì)菌進(jìn)行了dPCR檢測(cè)(圖 5)，分別用兩種不同顏色的熒光探針標(biāo)記兩種細(xì)菌，PCR擴(kuò)增后可以同時(shí)對(duì)兩種顏色熒光微液滴進(jìn)行檢測(cè)計(jì)數(shù)，從而得到兩種細(xì)菌在初始溶液中的絕對(duì)定量結(jié)果，用這種方法對(duì)飲用水的檢測(cè)精度可以達(dá)到10 CFU/mL。在食品安全領(lǐng)域，為了適應(yīng)歐盟對(duì)轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的嚴(yán)格要求，Dobnik等[51]提出并驗(yàn)證了利用液滴dPCR技術(shù)對(duì)歐盟境內(nèi)種植的12種轉(zhuǎn)基因玉米進(jìn)行快速檢測(cè)的方法。Dany等也使用dPCR—實(shí)時(shí)熒光PCR聯(lián)用技術(shù)對(duì)食品、飼料、種子中的轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行了測(cè)定，在提高精度的同時(shí)也降低了檢測(cè)成本。

在液滴微流控技術(shù)與dPCR的結(jié)合應(yīng)用方面也有一些商業(yè)化產(chǎn)品，如Bio-Rad公司的QX系列液滴dPCR檢測(cè)系統(tǒng)，其中QX100系統(tǒng)中的液滴微流控芯片可以在一次分析中將樣品溶液分成11.2萬(wàn)~12.8萬(wàn)個(gè)小液滴，每塊芯片的價(jià)格僅為24美元。在QX100系統(tǒng)中，使用了前文提到過(guò)的十字形的微流道，分散相溶液在連續(xù)相油的擠壓中不斷產(chǎn)生小液滴，通過(guò)數(shù)個(gè)液滴產(chǎn)生微流控芯片的并行協(xié)作，在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生了大量的小液滴，每個(gè)小液滴就是一個(gè)反應(yīng)容器；PCR熱循環(huán)擴(kuò)增結(jié)束后，又使用微流控技術(shù)，使小液滴依次通過(guò)檢測(cè)裝置對(duì)其進(jìn)行熒光檢測(cè)，完成計(jì)數(shù)過(guò)程。與之相似，RainDance公司的Rraindrop系統(tǒng)附帶的微流控芯片的8個(gè)進(jìn)樣通道同時(shí)工作時(shí)，最高可將樣品溶液分為8000萬(wàn)個(gè)pL級(jí)的微液滴，每塊微流控芯片的成本也只有80~240美元。相比之下，F(xiàn)luidigm公司BioMark系統(tǒng)使用的基于IFC技術(shù)的微流控芯片中的12個(gè)反應(yīng)單元陣列加起來(lái)也僅有9180個(gè)反應(yīng)單元，每塊芯片價(jià)格卻高達(dá)400美元。由此可見(jiàn)，從單個(gè)芯片的價(jià)格和對(duì)反應(yīng)溶液分割的份數(shù)來(lái)看，液滴微流控芯片相比于IFC芯片都擁有巨大的優(yōu)勢(shì)。

典型的商業(yè)化液滴dPCR系統(tǒng)的工作原理如圖 6所示，含有目的基因、Taq聚合酶、引物、分子信標(biāo)(如：TaqMan等)的溶液經(jīng)過(guò)微流控芯片，被分為數(shù)百萬(wàn)個(gè)微液滴，分散的微液滴被收集在離心管中進(jìn)行PCR熱循環(huán)擴(kuò)增，擴(kuò)增的同時(shí)，通過(guò)熒光探針/分子信標(biāo)標(biāo)記目的基因，最后，微液滴被重新送入微流控芯片中，微液滴依次通過(guò)熒光傳感器進(jìn)行檢測(cè)，最后得到數(shù)據(jù)分析圖。值得一提的是，現(xiàn)階段微液滴一般可以通過(guò)熒光探針標(biāo)記兩種顏色，如果對(duì)熒光探針的強(qiáng)度進(jìn)行控制，基于兩種顏色的探針最多可以達(dá)到12個(gè)標(biāo)記的多重分析。

結(jié)語(yǔ)和展望

與傳統(tǒng)的依靠標(biāo)準(zhǔn)曲線和循環(huán)閾值進(jìn)行定量檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)相比，在目標(biāo)基因的定量精度和靈敏度方面，dPCR具有非常明顯優(yōu)勢(shì)：通過(guò)對(duì)溶液的高度稀釋和分割，每份溶液中都至多含有一個(gè)目標(biāo)基因，在擴(kuò)增后，通過(guò)熒光檢測(cè)，可以準(zhǔn)確定量分析出原始溶液中的目標(biāo)基因數(shù)量。

dPCR技術(shù)在基因工程、疾病檢測(cè)以及環(huán)境工程等領(lǐng)域得到了較為廣泛的應(yīng)用，無(wú)疑是未來(lái)PCR技術(shù)的發(fā)展方向。液滴dPCR是近年來(lái)興起的一項(xiàng)新dPCR技術(shù)，是微流控技術(shù)與dPCR結(jié)合產(chǎn)生的新成果。相比于基于IFC的dPCR芯片，液滴dPCR對(duì)反應(yīng)溶液的分割數(shù)量增加了上千倍，可以容易地將反應(yīng)溶液分割為數(shù)百萬(wàn)份含有至多一個(gè)目標(biāo)基因的微液滴，大大提高了定量分析精密度，不僅推動(dòng)了dPCR在更多領(lǐng)域的應(yīng)用，且顯著降低了dPCR技術(shù)的成本。

目前，包括液滴dPCR在內(nèi)的整個(gè)dPCR技術(shù)還處于發(fā)展初期，與液滴dPCR相關(guān)的液滴微流控芯片技術(shù)、多重?zé)晒馓结槨⒎磻?yīng)后微液滴的高速檢測(cè)等相比還有很大發(fā)展的空間。在液滴微流控芯片技術(shù)方面，其技術(shù)難點(diǎn)在于大規(guī)模高通量的液滴產(chǎn)生技術(shù)，高通量往往是通過(guò)增加芯片中的液體流動(dòng)速度和采用數(shù)塊微流控芯片并行運(yùn)作實(shí)現(xiàn)的，這對(duì)芯片的設(shè)計(jì)、微通道的加工、芯片的鍵合等都提出了更高的要求，是未來(lái)技術(shù)攻關(guān)的重要難點(diǎn)之一。在多重?zé)晒馓结樀氖褂梅矫妫鄶?shù)實(shí)驗(yàn)室研究和商業(yè)化產(chǎn)品使用的都是1~2個(gè)熒光探針，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)1~2個(gè)目標(biāo)基因的同時(shí)檢測(cè)。在未來(lái)的dPCR技術(shù)發(fā)展中，提高熒光探針數(shù)量必然是發(fā)展趨勢(shì)之一，在一次dPCR檢測(cè)中對(duì)多個(gè)目標(biāo)基因進(jìn)行定量分析，大大提高效率，降低成本，對(duì)醫(yī)學(xué)檢測(cè)等領(lǐng)域的應(yīng)用有著重要意義。前面提到的高通量液滴產(chǎn)生技術(shù)和多重?zé)晒馓结樇夹g(shù)也都對(duì)PCR擴(kuò)增后的熒光檢測(cè)系統(tǒng)提出了更高的要求，在非常短的時(shí)間內(nèi)，不僅需要熒光檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)液滴是否具有熒光做出判定，還需要對(duì)熒光的顏色做出準(zhǔn)確判斷，所以，未來(lái)dPCR技術(shù)發(fā)展中高速熒光檢測(cè)和信號(hào)處理也是亟待解決的難題。

此外，值得重點(diǎn)關(guān)注的是液滴dPCR技術(shù)的高成本問(wèn)題。目前，為了保證內(nèi)部微流道潔凈，只能一次性使用的液滴微流控芯片的成本仍然過(guò)高，使得整個(gè)液滴dPCR技術(shù)的檢測(cè)成本高昂，影響了液滴dPCR技術(shù)的普及。微流控芯片成本的絕大部分源自微加工技術(shù)和芯片材料，相信未來(lái)隨著微流控技術(shù)的高速發(fā)展，各種低成本的微加工方法的不斷涌現(xiàn)和各類低成本材料的使用，會(huì)在很大程度上降低液滴dPCR技術(shù)的成本。從降低成本方面考慮，研發(fā)應(yīng)用于液滴dPCR技術(shù)中的高通量、低成本微流控芯片也必將是未來(lái)的發(fā)展方向之一。

免責(zé)聲明：文章來(lái)源網(wǎng)絡(luò)  以傳播知識(shí)、有益學(xué)習(xí)和研究為宗旨。 轉(zhuǎn)載僅供參考學(xué)習(xí)及傳遞有用信息，版權(quán)歸原作者所有，如侵犯權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)系刪除。