D-阿洛酮糖（D-allulose）是一種理想的低能量甜味劑替代品，同時其具有抗高血糖、抗動脈粥樣硬化、降低血脂水平、神經(jīng)保護和清除活性氧等多種有益的生理功能。生物酶法合成D-阿洛酮糖可以通過酮糖3-差向異構(gòu)酶（KEase）特異性催化D-果糖C3位的差向異構(gòu)實現(xiàn)，其具有高特異性、高催化活性等優(yōu)勢，在D-阿洛酮糖的生產(chǎn)應(yīng)用中得到廣泛認可。然而，目前已報道鑒定的該家族酶在工業(yè)生產(chǎn)條件下催化活性不足且耐受性差，嚴重阻礙了其在生物轉(zhuǎn)化中的廣泛應(yīng)用。因此，開發(fā)高活性、高耐受性的KEase是實現(xiàn)D-阿洛酮糖工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵。同時，基于傳統(tǒng)微孔板篩選的模式通常耗時且效率低下，無法滿足酶分子大規(guī)模突變體庫高效篩選的需求，因此開發(fā)高效的篩選新策略以加速酶分子定向進化進程具有重要的意義。針對上述面臨的問題， 天津科技大學(xué)路福平 教授、 秦慧民 教授研究團隊 設(shè)計并優(yōu)化了基于生物傳感器的微液滴超高通量篩選平臺，結(jié)合結(jié)構(gòu)指導(dǎo)的理性設(shè)計及定向進化，實現(xiàn)了合成D-阿洛酮糖的差向異構(gòu)酶的高效催化 。相關(guān)成果發(fā)表于 Angewandte Chemie 上。

研究團隊首先利用特異性響應(yīng)D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子PsiR及其調(diào)控的啟動子系統(tǒng)搭建了可以檢測體系中D-阿洛酮糖含量的生物傳感器系統(tǒng)，利用綠色熒光蛋白（mEmerald）作為信號輸出模塊，將體系中D-阿洛酮糖的含量與宿主菌熒光信號強度相耦聯(lián)。進一步地，通過設(shè)計基于微孔板的篩選策略，該研究對調(diào)控因子PsiR進行了功能改造，大大改善了生物傳感器系統(tǒng)對D-阿洛酮糖的響應(yīng)靈敏度。同時，基于結(jié)構(gòu)模型分析，揭示了調(diào)控因子改善對D-阿洛酮糖響應(yīng)靈敏性的分子機理。

圖1. D-阿洛酮糖生物傳感器的設(shè)計及優(yōu)化

進一步地，該研究將上述傳感器系統(tǒng)與KEase表達系統(tǒng)相耦合，實現(xiàn)了目標酶催化活性與宿主菌熒光信號的關(guān)聯(lián)，搭建了基于熒光檢測的目標酶篩選系統(tǒng)。為了避免目標檢測分子D-阿洛酮糖在篩選反應(yīng)池中的串?dāng)_，本研究借助液滴微流控平臺優(yōu)秀的單細胞分離及分選能力，結(jié)合上述體內(nèi)酶篩選傳感器系統(tǒng)，構(gòu)建了KEase酶的微液滴高通量篩選策略：1）目標酶突變體庫的構(gòu)建；2）突變體庫單細胞及相關(guān)試劑液滴共包裹；3）單細胞液滴適溫培養(yǎng)；4）基于液滴內(nèi)細胞熒光信號的液滴分選，收集陽性液滴；5）回收陽性變體，進行活性分析。

圖2. 基于生物傳感器的微液滴高通量篩選策略

該研究以來自于 Sinorhizobium fredii CCBAU 83666的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶（SfDAE）為研究對象，通過蛋白晶體結(jié)構(gòu)衍射獲取酶分子結(jié)構(gòu)信息，鑒定了酶分子催化活性口袋重要氨基酸位點（催化殘基、金屬離子結(jié)合殘基等），同時運用結(jié)構(gòu)生物學(xué)和分子動力學(xué)模擬的方法首次識別了該家族酶位于底物結(jié)合口袋處的高靈活性蓋子結(jié)構(gòu)，其在底物分子進入酶分子活性口袋的過程中呈現(xiàn)有規(guī)律的“打開”和“關(guān)閉”兩種主要構(gòu)象，揭示了其在底物進入酶分子活性口袋的過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的調(diào)控作用。

圖3. SfDAE結(jié)構(gòu)分析及分子動力學(xué)模擬

基于酶分子結(jié)構(gòu)信息，該研究利用上述微液滴高通量篩選平臺對酶分子進行設(shè)計，以優(yōu)化活性中心及高靈活蓋子區(qū)域關(guān)鍵氨基酸殘基，同時結(jié)合定向進化理論從酶分子全局出發(fā)進行高通量定向篩選，在維持其高熱穩(wěn)定性的同時，將目標酶SfDAE的催化效率提升了17倍?；诮Y(jié)構(gòu)分析及分子動力學(xué)模擬，揭示關(guān)鍵氨基酸殘基突變的引入重塑了酶分子活性位點的結(jié)構(gòu)構(gòu)象和底物口袋的大小，同時改善了蓋子區(qū)域的靈活性及擺動范圍，進而闡明了酶分子催化效率提升的分子機理。

圖4. 基于結(jié)構(gòu)的SfDAE理性設(shè)計及定向篩選

小結(jié)

該研究工作成功設(shè)計并優(yōu)化了基于生物傳感器的微液滴高通量篩選系統(tǒng)，以作為一種低成本、高通量的酶篩選工具，用于定向進化KEase及其他D-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化相關(guān)酶?；诿阜肿咏Y(jié)構(gòu)信息的解析，首次識別了KEase家族酶位于底物結(jié)合口袋處對底物識別具有重要調(diào)控作用的蓋子結(jié)構(gòu)，以結(jié)構(gòu)信息為導(dǎo)向的理性設(shè)計結(jié)合隨機突變的高通量定向篩選，開發(fā)了高性能KEase，用于D-阿洛酮糖的高效合成。本研究對D-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化相關(guān)酶的功能改造具有指導(dǎo)意義，同時為酶功能改造提供一種高效篩選的新方法。

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