摘要：液滴微流控技術(shù)在微納米尺度上對(duì)多種流體的流動(dòng)進(jìn)行精確控制，從而能夠以高通量的方式生成結(jié)構(gòu)可調(diào)和成分可控的微納米液滴。通過(guò)結(jié)合合適的水凝膠材料和制造方法，可以將單個(gè)或多個(gè)細(xì)胞高效地封裝進(jìn)水凝膠中，制備細(xì)胞凝膠微球。細(xì)胞凝膠微球可以為細(xì)胞的增殖、分化等提供一個(gè)三維的、相對(duì)獨(dú)立可控的微環(huán)境，在三維細(xì)胞培養(yǎng)、組織工程與再生醫(yī)學(xué)、干細(xì)胞研究和單細(xì)胞研究等生命科學(xué)領(lǐng)域具有重要價(jià)值。本文主要綜述了基于液滴微流控技術(shù)的細(xì)胞凝膠微球的制備及其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，并對(duì)未來(lái)的研究工作提出了展望。

1 液滴微流控

微流控技術(shù)是一種可以在微納米尺度上處理和操控少量液體(10–9?10–18 L)系統(tǒng)的技術(shù)，基于微流控技術(shù)的裝置稱(chēng)為微流控芯片，具有微型化、集成化等特點(diǎn)。液滴微流控是指通過(guò)微通道內(nèi)互不相容的多相流體生成離散的液滴，并對(duì)其進(jìn)行操控?；谖⒘骺丶夹g(shù)生成的液滴具有單分散性好、無(wú)交叉污染、可重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于生物、化學(xué)、物理等多個(gè)學(xué)科領(lǐng)域，成為微流控領(lǐng)域的一個(gè)重要分支。

生成液滴的方法和技術(shù)有很多種，根據(jù)液滴生成過(guò)程中是否施加外部能量，可以分為被動(dòng)法和主動(dòng)法。被動(dòng)法生成液滴，是指利用不同的微通道結(jié)構(gòu)使不混溶的分散相和連續(xù)相流體在通道連接處相遇，通過(guò)調(diào)節(jié)通道結(jié)構(gòu)、兩相流速大小及流速比，可以在通道連接處下游生成大小可控的液滴。根據(jù)通道幾何形狀的不同，被動(dòng)法生成液滴(表 1)又可以分為T(mén)型通道法(T-junction)、流聚焦法(flow-focusing)和共軸流法(co-flow)。主動(dòng)法生成液滴是指在液滴生成過(guò)程中，通過(guò)局部施加電場(chǎng)力、磁場(chǎng)力和離心力等外力控制液滴的生成(表 2)。

表 1 被動(dòng)法生成液滴的特點(diǎn)和微通道結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖

表 2 主動(dòng)法生成液滴的原理和特點(diǎn)

近年來(lái)，液滴微流控技術(shù)的發(fā)展主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：在芯片制造方面，由于新材料的不斷引入和技術(shù)的進(jìn)步，微流控芯片經(jīng)歷了由硅、玻璃、聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane, PDMS)到紙基材料的變化；在液滴生成動(dòng)力學(xué)方面，深入研究了液滴的生成原理，即液滴通常是在被動(dòng)的流體壓力或主動(dòng)的外部驅(qū)動(dòng)下生成的，了解其獨(dú)特的流體動(dòng)力學(xué)可以對(duì)液滴及液滴界面進(jìn)行精確控制，也使得設(shè)計(jì)新穎的液滴微流控系統(tǒng)來(lái)生成和操縱具有不同結(jié)構(gòu)和功能的液滴成為可能；在應(yīng)用方面，隨著理論和技術(shù)的進(jìn)步，液滴微流控在微反應(yīng)器、組織工程與再生醫(yī)學(xué)、藥物輸送、人工細(xì)胞、腫瘤免疫療法和單細(xì)胞研究等諸多領(lǐng)域均占據(jù)了重要的一席。

2 細(xì)胞凝膠微球的制備

液滴微流控技術(shù)能夠以高通量的方式制備大小、成分和功能可控的單分散液滴，這些液滴可以封裝一種或多種細(xì)胞，作為模板來(lái)制備具有特定理化性質(zhì)且能夠抗剪切應(yīng)力的細(xì)胞凝膠微球。用來(lái)進(jìn)行封裝細(xì)胞的水凝膠材料種類(lèi)繁多，主要可以分為兩大類(lèi)：一類(lèi)是天然高分子，包括海藻酸鹽、殼聚糖、瓊脂糖、明膠、纖維蛋白原和多肽等；另一類(lèi)是合成聚合物，包括聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)、聚丙烯酸(polyacrylic acid, PAA)和聚乙烯醇(polyvinyl alcohol, PVA)等。天然高分子具有良好的生物相容性和可降解性，合成聚合物在機(jī)械性能和生化信號(hào)的可控性方面具有優(yōu)勢(shì)，因此，實(shí)際應(yīng)用中通常采用混合水凝膠，結(jié)合二者的優(yōu)勢(shì)，能夠?yàn)榧?xì)胞提供可控的微環(huán)境和必要的錨定位點(diǎn)，并調(diào)控細(xì)胞的生命活動(dòng)。

在典型的細(xì)胞封裝過(guò)程中，含有細(xì)胞的水凝膠前體溶液經(jīng)過(guò)連續(xù)相的剪切，形成一個(gè)個(gè)單分散液滴，通過(guò)觸發(fā)交聯(lián)，形成細(xì)胞凝膠微球。微球的尺寸、形狀、孔隙率和機(jī)械性能可以通過(guò)改變微通道尺寸、兩相流速、水凝膠材料、水凝膠濃度以及交聯(lián)密度等因素來(lái)調(diào)節(jié)。根據(jù)封裝細(xì)胞的水凝膠材料的不同，制備細(xì)胞凝膠微球的交聯(lián)方式各異，主要包括光交聯(lián)、離子交聯(lián)和溫度誘導(dǎo)交聯(lián)等(圖 1)。

圖 1 細(xì)胞凝膠微球的制備方式

A：光交聯(lián). B：離子交聯(lián). C：溫度誘導(dǎo)交聯(lián)

2.1 光交聯(lián)

光交聯(lián)通常是在可聚合材料中加入光引發(fā)劑，待生成前體液滴后再將其置于可見(jiàn)光或紫外光的照射下引發(fā)聚合。這一過(guò)程發(fā)生速度快，可在數(shù)秒內(nèi)誘導(dǎo)交聯(lián)，液滴穩(wěn)定性好，對(duì)細(xì)胞的損傷較小，是目前應(yīng)用最廣泛的交聯(lián)方法之一。光交聯(lián)的關(guān)鍵除了光引發(fā)劑的選擇和嚴(yán)格控制光引發(fā)劑的濃度與光照時(shí)間外，選擇合適的可聚合材料也很重要。目前，可用于構(gòu)建光交聯(lián)的生物相容性水凝膠材料主要包括透明質(zhì)酸、明膠和殼聚糖等天然大分子以及聚乙二醇、聚丙烯酰胺和聚丙烯酸酯等合成大分子。Finklea等將人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(human induced pluripotent stem cells, hiPSCs)包裹在聚乙二醇修飾的纖維蛋白原前體液滴中，液滴在可見(jiàn)光下照射1.6 s即可完成交聯(lián)，形成載hiPSCs的凝膠微球。聚乙二醇修飾的纖維蛋白原水凝膠顯示出優(yōu)異的生物相容性和機(jī)械性能，載hiPSCs凝膠微球在誘導(dǎo)分化第8天即可分化為心臟組織，該工程化心臟組織呈現(xiàn)自主收縮功能，并保持自發(fā)收縮長(zhǎng)達(dá)3年以上，能夠?qū)λ幚韺W(xué)和電刺激產(chǎn)生反應(yīng)。

2.2 離子交聯(lián)

可用于細(xì)胞封裝的離子交聯(lián)水凝膠主要包括海藻酸鹽和殼聚糖，其中海藻酸鹽是研究最多的材料之一。海藻酸鹽對(duì)二價(jià)陽(yáng)離子(如Ca2+)有很強(qiáng)的親和力，其帶負(fù)電荷的多糖殘基可以與Ca2+發(fā)生離子反應(yīng)，從而觸發(fā)交聯(lián)，交聯(lián)劑Ca2+的濃度顯著影響海藻酸鹽水凝膠的交聯(lián)度。當(dāng)Ca2+濃度較高時(shí)，形成的海藻酸鹽水凝膠結(jié)構(gòu)比較緊密，特別是水凝膠的外部會(huì)直接接觸含有Ca2+的水溶液，從而在接觸瞬間發(fā)生固化。而當(dāng)Ca2+濃度較低時(shí)，固化速度相對(duì)較慢，形成的海藻酸鹽水凝膠結(jié)構(gòu)更均勻，具有更高的機(jī)械穩(wěn)定性。由于離子交聯(lián)發(fā)生迅速，當(dāng)液滴形成和凝膠化同時(shí)進(jìn)行時(shí)，容易導(dǎo)致微通道堵塞以及凝膠化不均勻，因而Utech等以鈣-乙二胺四乙酸(Ca-EDTA)絡(luò)合物的形式提供Ca2+。他們將Ca-EDTA絡(luò)合物水溶液與多肽(Arg-Gly-Asp, RGD)修飾的海藻酸鹽水溶液均勻混合作為分散相，此時(shí)由于Ca2+與EDTA絡(luò)合，Ca2+不會(huì)與海藻酸鹽發(fā)生交聯(lián)。當(dāng)液滴形成后，通過(guò)向連續(xù)相中添加低濃度的乙酸降低液滴中的pH，使得Ca-EDTA絡(luò)合物發(fā)生解離并釋放出Ca2+，進(jìn)而引發(fā)交聯(lián)。Utech等利用該方式制備了包裹間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)的海藻酸鈣凝膠微球，可以觀察到微球中的MSCs在培養(yǎng)過(guò)程中穩(wěn)定增殖，培養(yǎng)至第15天時(shí)細(xì)胞存活率仍保持在70%以上。

2.3 溫度誘導(dǎo)交聯(lián)

溫敏材料通常都是通過(guò)分子間的氫鍵、疏水作用、范德華力以及π-π作用等較弱的相互作用而形成的，溫度的改變會(huì)影響或破壞這些作用，從而使凝膠狀態(tài)發(fā)生改變。故可以通過(guò)調(diào)節(jié)外界溫度，觸發(fā)對(duì)溫度敏感的水凝膠發(fā)生交聯(lián)?？捎糜诩?xì)胞封裝的溫度敏感性水凝膠主要包括膠原蛋白、瓊脂糖、明膠和殼聚糖等天然大分子。此外，還可以通過(guò)在天然水凝膠上修飾人工合成基團(tuán)，比如在殼聚糖上修飾PEG或PVA大分子，進(jìn)一步優(yōu)化水凝膠的溫度敏感性、溶解性和機(jī)械性能。已知膠原蛋白處于4 ℃時(shí)是液體狀態(tài)，而當(dāng)溫度上升到37 ℃時(shí)則轉(zhuǎn)變?yōu)槟z態(tài)?；诖?，Kukla等在4 ℃環(huán)境下將原代人肝細(xì)胞(primary human hepatocyte, HPP)重懸于Ⅰ型大鼠尾膠原蛋白溶液中，借助流聚焦型液滴微流控芯片生成了包裹HPP的膠原蛋白前體液滴。收集液滴并將其置于37 ℃環(huán)境下孵育以促進(jìn)膠原蛋白凝膠化，最終形成平均直徑在267.4 μm左右的“微組織”。這種“微組織”不僅可以作為3D人體肝臟模型用于臨床前藥物開(kāi)發(fā)，還可以通過(guò)與不同細(xì)胞共培養(yǎng)來(lái)研究肝臟疾病中細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)之間的相互作用。

細(xì)胞凝膠微球在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

人體內(nèi)的細(xì)胞存在于由蛋白質(zhì)和多糖組成的復(fù)雜三維微環(huán)境—ECM中，天然的ECM是一種動(dòng)態(tài)的、層次分明的物質(zhì)，它不僅是細(xì)胞的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，也是觸發(fā)和調(diào)節(jié)細(xì)胞行為的生化和生物物理因素的來(lái)源。然而，現(xiàn)有的細(xì)胞培養(yǎng)大多是建立在二維培養(yǎng)皿培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，這種二維培養(yǎng)難以真實(shí)地反映細(xì)胞的體內(nèi)微環(huán)境。水凝膠具有高含水量、生物相容性、降解性和多孔性等與天然ECM相似的獨(dú)特性能，并且可以方便地調(diào)整其組成、結(jié)構(gòu)、機(jī)械性能和生化性能，因而其作為一種人工ECM在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用?；谝旱挝⒘骺厣傻募?xì)胞凝膠微球呈三維多孔結(jié)構(gòu)，粒徑通常在60?200 μm之間，其多孔結(jié)構(gòu)和高表體比有利于氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的輸入以及代謝廢物的輸出，能夠使細(xì)胞在保持高活力的同時(shí)免受周?chē)h(huán)境的影響。此外，還可以在水凝膠中加入適宜的生長(zhǎng)因子，構(gòu)建能夠控制細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和分化的人工ECM，生長(zhǎng)于其中的細(xì)胞可以很好地與包裹它的水凝膠相互作用，因而這是一種有前途的體外三維細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)。本節(jié)主要討論三維細(xì)胞凝膠微球在組織工程與再生醫(yī)學(xué)、單細(xì)胞研究、腫瘤疫苗等領(lǐng)域的應(yīng)用(圖 2)。

圖 2 細(xì)胞凝膠微球在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用

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