摘要

病毒鑒定不僅是病毒性傳染病早期診斷的前提，也是有效預(yù)防流行病的前提。根據(jù)科赫假設(shè)，成功培養(yǎng)是識(shí)別病毒的黃金標(biāo)準(zhǔn)。然而，這需要篩選一種寬松的細(xì)胞系，這在傳統(tǒng)上是時(shí)間、試劑和勞動(dòng)密集型的。本文報(bào)道了一種簡(jiǎn)單易操作的微流控芯片，該芯片通過接種多種細(xì)胞系并平行培養(yǎng)而形成，可用于病毒培養(yǎng)和病毒允許的宿主細(xì)胞篩選。該芯片通過感染兩種已知病毒進(jìn)行測(cè)試，即腸道病毒 71 （EV71） 和流感病毒 H1N1。EV71 和 H1N1 感染分別在 RD 和 MDCK 細(xì)胞中引起顯著的細(xì)胞病變效應(yīng) （CPE），表明基于這種微流控細(xì)胞芯片的病毒培養(yǎng)可以替代傳統(tǒng)的基于平板的培養(yǎng)方法，并重現(xiàn)病毒感染引起的典型 CPE。使用這種微流控細(xì)胞芯片方法進(jìn)行病毒培養(yǎng)，可以以高通量、自動(dòng)和前所未有的快速方式識(shí)別新出現(xiàn)的病毒。

1. 引言

新發(fā)和再發(fā)傳染病，如嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥冠狀病毒（SARS-CoV）-2 和 SARS-CoV對(duì)人類構(gòu)成致命威脅。此外，2013-2016 年西非埃博拉病毒疫情導(dǎo)致 28,000 多例病例，占相關(guān)死亡人數(shù)的一半以上。在感染病毒性疾病的早期階段，避免患者惡化和預(yù)防其他致命并發(fā)癥的先決條件是確認(rèn)病毒類型或亞型。只有在確定病毒種類后，我們才能利用現(xiàn)有知識(shí)采取措施。因此，病毒的快速識(shí)別對(duì)于早期診斷和疫情防控至關(guān)重要。各種方法，包括血凝抑制和中和試驗(yàn)，核酸擴(kuò)增，免疫熒光測(cè)定，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定和下一代測(cè)序，通常應(yīng)用于病毒的早期診斷。目前，定量逆轉(zhuǎn)錄-PCR是病毒早期診斷的首選方法，因?yàn)樗哂懈咛禺愋院透哽`敏度的優(yōu)點(diǎn)。然而，根據(jù)Koch假設(shè)，基于活病毒細(xì)胞培養(yǎng)的噬菌斑測(cè)定是病毒鑒定和診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)于新出現(xiàn)的病毒，應(yīng)用斑塊檢測(cè)的主要問題是需要篩選病毒允許的細(xì)胞系。使用平板或培養(yǎng)皿進(jìn)行細(xì)胞和病毒培養(yǎng)的傳統(tǒng)方法耗時(shí)且耗費(fèi)試劑，勞動(dòng)密集型且靈敏度低。

基于微機(jī)電系統(tǒng)（MEMS）的微流控芯片可以處理微/納升尺度的流體，因此需要的試劑和臨床樣本量要少得多。更重要的是，通過使用微流控細(xì)胞芯片，可以實(shí)現(xiàn)具有不同細(xì)胞系和培養(yǎng)條件的高通量并行測(cè)試。特別是當(dāng)微流控細(xì)胞芯片與處理和控制設(shè)備集成時(shí)，創(chuàng)建自動(dòng)高通量培養(yǎng)和篩選系統(tǒng)將成為可能。

本文設(shè)計(jì)了由聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）上下蓋板、聚乳酸（PLA）框架、聚二甲基硅氧烷（PDMS）芯片和底部金屬框架組裝而成的微流控芯片，用于培養(yǎng)不同的細(xì)胞系，以篩選病毒允許的細(xì)胞。在PDMS芯片上同時(shí)培養(yǎng)用于病毒培養(yǎng)的5種常見宿主細(xì)胞系A(chǔ)549、BHK21、Vero、RD和MDCK。通過逐漸改變培養(yǎng)基含量，使不同的細(xì)胞系適應(yīng)相同的培養(yǎng)基。然后，以腸道病毒71型（EV71）和流感病毒H1N1為模型病毒，在微流控培養(yǎng)系統(tǒng)中測(cè)試細(xì)胞芯片，以篩選病毒允許的細(xì)胞。與傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)方法相比，該細(xì)胞芯片可以重現(xiàn)被測(cè)病毒的典型細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE），并具有允許篩選多種潛在宿主細(xì)胞系以獲得最佳病毒允許細(xì)胞系的額外優(yōu)勢(shì)。這項(xiàng)研究為開發(fā)高通量細(xì)胞培養(yǎng)芯片鋪平了道路，這些芯片將有助于有效的病毒分離和抗病毒藥物篩選。

2.材料與方法

2.1. 設(shè)備設(shè)計(jì)與生成

微流控芯片由上下芯片蓋、芯片框架和PDMS培養(yǎng)芯片組成。上下芯片蓋板通過激光切割由PMMA板預(yù)制而成，金屬框架由鋁板通過計(jì)算機(jī)數(shù)控（CNC）加工直接制造而成。使用桌面 delta RepRap 3D 打印機(jī) 3D 打印尺寸與 PDMS 培養(yǎng)芯片尺寸相對(duì)應(yīng)的 PLA 框架。器件設(shè)計(jì)和組裝的詳細(xì)原理圖如圖1所示。

圖 1.微流控芯片設(shè)計(jì)與制造示意圖.用于制造微流控芯片的定制模具技術(shù)的工藝。

首先，通過SolidWorks設(shè)計(jì)PDMS細(xì)胞培養(yǎng)芯片模具，并將設(shè)計(jì)文件轉(zhuǎn)換為STL文件，由3D打印機(jī)識(shí)別。其次，PDMS芯片模具通過DLP或SLA3D打印機(jī)在不到一個(gè)小時(shí)的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)，所得打印模具經(jīng)過物理或化學(xué)拋光，產(chǎn)生光滑的槽面。第三，將脫氣的PDMS預(yù)混料（Sylgard 184）倒入模具中，將模具置于70°C的烘箱中1 h，使液體PDMS固化。然后緩慢而小心地將固化的PDMS芯片從芯片模具中剝離。組裝微流控芯片后的最后一步，是用螺絲密封芯片并安裝入口/出口連接器。

2.2. 研究中使用的細(xì)胞系和病毒株

本研究中使用的所有細(xì)胞系均購自美國(guó)組織型培養(yǎng)保藏中心（ATCC，美國(guó)）。使用以下五種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系進(jìn)行研究：人腺癌肺泡基底上皮細(xì)胞（A549，CCL-185），非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero，CCL-81），Madin-Darby犬腎上皮細(xì)胞（MDCK，CCL-34），人橫紋肌肉瘤細(xì)胞（RD，CCL-136）和倉鼠腎成纖維細(xì)胞（BHK-21，CCL-10）。為了維持，BHK-21、MDCK和RD細(xì)胞在補(bǔ)充有10%胎牛血清（FBS，10099-141C，Gibco）和100單位/ mL青霉素 - 鏈霉素的最小必需培養(yǎng)基（MEM，41500，Gibco，Thornton，Australia）中培養(yǎng)，在37°C的5%CO 2氣氛中;在相同條件下將 A549 和 Vero 細(xì)胞維持在 DMEM 中。對(duì)于感染，EV71 使用含有 1% FBS 的 Dulbecco 改良的 Eagle 培養(yǎng)基（DMEM，12800，Gibco），將含有 2% 牛血清白蛋白（BSA，H1130，Solarbio，北京，中國(guó)）和 2 μg/mL TPCK-胰蛋白酶（9002-07-7，Macklin，上海，中國(guó)）的 DMEM 用于甲型流感病毒。在與微流控芯片平行的 96 孔板的實(shí)驗(yàn)中，使用與芯片相同的介質(zhì)。

人EV71（中國(guó)疫苗株，GenBank編號(hào)。HQ328793，武漢病毒研究所微生物和病毒培養(yǎng)物收集中心）和甲型流感病毒[A/Puerto Rico/8/1934（H1N1），武漢病毒研究所微生物和病毒培養(yǎng)物收集中心]分別在RD細(xì)胞和MDCK細(xì)胞中傳代了四個(gè)周期。所有感染實(shí)驗(yàn)均在BSL-2實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

2.3. 病毒滴度計(jì)算

在 96 孔板中接種 1 × 104 個(gè)細(xì)胞/孔的 RD 或 MDCK 細(xì)胞。將病毒的連續(xù) 10 倍稀釋液加入孔中。將細(xì)胞和稀釋的病毒一起孵育48小時(shí)后，在倒置顯微鏡的明場(chǎng)設(shè)置下檢查CPE，并按照Behrens-Reed-Muench方法計(jì)算病毒50%組織培養(yǎng)感染劑量（TCID50）。將所得病毒滴度為7 × 108 TCID50/mL（EV71，補(bǔ)充表S1）和1.6 × 108 TCID50/mL（甲型流感病毒，補(bǔ)充表S2），在-80°C下儲(chǔ)存直至進(jìn)一步使用。在感染實(shí)驗(yàn)中，感染的多重性（MOI）計(jì)算為病毒滴度PFU，其由TCID50（Bryan，1957）轉(zhuǎn)換而來，使用公式為：MOI = PFU /（接種細(xì)胞數(shù)）。

2.4. 芯片上細(xì)胞系培養(yǎng)

PDMS培養(yǎng)室涂有0.1mg / mL聚-l-賴氨酸（BS197，Biosharp，合肥，中國(guó)），滅菌，然后在4°C下儲(chǔ)存過夜。用磷酸鹽緩沖鹽水沖洗后，將芯片風(fēng)干。將 A549、Vero、RD、BHK-21 或 MDCK 細(xì)胞以 1 × 104/孔的密度接種到芯片室中，與其他芯片組分組裝在一起進(jìn)行連續(xù)靜態(tài)培養(yǎng)。芯片上的培養(yǎng)基是含有 1% FBS 的 DMEM，每 12 小時(shí)以 2 mL/h 的流速灌注 0.5 小時(shí)，直至培養(yǎng)過程結(jié)束。在接種后6小時(shí)和12小時(shí)，使用配備數(shù)碼相機(jī)的倒置顯微鏡（IX73，Olympus，Tokyo，Japan）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行成像。

2.5. 96孔板中的病毒感染

96 孔板中的細(xì)胞在指定的 MOI 處被 EV71（A549、Vero 和 RD 細(xì)胞）或流感病毒 H1N1（A549、Vero 和 MDCK 細(xì)胞）感染。在感染后指定的時(shí)間點(diǎn)，使用配備數(shù)碼相機(jī)的倒置顯微鏡（IX73，奧林巴斯）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行成像。

2.6. 芯片上的病毒感染

在感染前12小時(shí)將細(xì)胞接種在芯片的培養(yǎng)室中。然后，將包含加載單元的PDMS芯片小心地嵌入PLA框架中，其余的芯片組件按順序組裝。A549、Vero 和 RD 細(xì)胞在指定的 MOI 處感染 EV71。A549、Vero 和 MDCK 細(xì)胞在指定的 MOI 處感染流感病毒 H1N1。在感染后指定的時(shí)間點(diǎn)，使用配備數(shù)碼相機(jī)的倒置顯微鏡（IX73，奧林巴斯）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行成像。芯片上細(xì)胞排列（對(duì)應(yīng)含病毒樣本的流向）為EV71感染的A549-Vero-RD、A549-RD-Vero或RD-A549-Vero，H1N1感染的A549-Vero-MDCK、A549-MDCK-Vero或MDCK-A549-Vero。每次感染試驗(yàn)重復(fù)三次。

為了定量流感病毒H1N1 RNA，將A549、Vero和MDCK細(xì)胞接種在96孔板或如上所述的芯片上，然后在指定的MOI下感染流感病毒H1N1。同樣，樣本是在感染后指定的時(shí)間點(diǎn)冷凍后收獲的。采用甲型流感病毒核酸檢測(cè)試劑盒（DAJY-001-24T，中山大學(xué)大安基因有限公司，中國(guó)廣州）和一步法實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)病毒復(fù)制水平。樣品制備和反應(yīng)系統(tǒng)按照制造商的說明進(jìn)行。在Bio-Rad CFX Connect RT-qPCR儀器（CFX96）上處理樣品，并使用CFX Manager（3.1版）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

3. 結(jié)果

3.1. 微流控芯片的設(shè)計(jì)與組裝

從上到下，由PMMA（作為上蓋）、PLA（作為框架）、PDMS（作為培養(yǎng)芯片）和PMMA（作為下蓋）在金屬框架內(nèi)組裝出微流控芯片器件。PDMS芯片的尺寸為70 mm×28 mm×3.3 mm，內(nèi)置培養(yǎng)室直徑為6 mm，高度為2 mm。最初安裝芯片時(shí)，以 2 mL/h 的速率將培養(yǎng)基注入細(xì)胞室。為了通過提供足夠的營(yíng)養(yǎng)和氧氣來支持細(xì)胞的生長(zhǎng)，每 12 小時(shí)以 2 mL/h 的速度注入培養(yǎng)基 30 分鐘（圖 2）。每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)室的體積為56.52μL。每個(gè)芯片有 10 個(gè)腔室，單個(gè)芯片的總腔室體積為 565.2 μL。連接腔室和外部管路的微流體通道內(nèi)的總體積為 314 μL。因此，腔室、通道和管道體積的總和為 879.2 μL，小于 1000 μL。因此，使用2 mL/h的流速30分鐘，進(jìn)樣1000 μL新鮮培養(yǎng)基，足以替換整個(gè)芯片的培養(yǎng)基。

圖 2.微流控芯片的原理。PMMA，聚甲基丙烯酸甲酯;PDMS，聚二甲基硅氧烷。

這種設(shè)計(jì)的優(yōu)點(diǎn)在于，通過使用三維（3D）打印，可以在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)定制的芯片通道結(jié)構(gòu)（圖1）。與傳統(tǒng)的微流控細(xì)胞接種相比，細(xì)胞培養(yǎng)室的表面易于預(yù)處理，在單個(gè)芯片中也很容易實(shí)現(xiàn)不同細(xì)胞系的接種。此外，PDMS芯片可以在細(xì)胞接種完成后組裝成微流控器件，從而通過將各種PDMS芯片與不同的細(xì)胞集成來重建微流控芯片。

3.2. 在微流控芯片上培養(yǎng)不同細(xì)胞系

A549，Vero，RD，MDCK和BHK-21細(xì)胞系，它們對(duì)不同的病毒（包括腸道病毒，單純病毒，水皰病毒，埃博拉樣病毒和黃病毒）敏感（Phanthanawiboon等人，2014;Alonso 和 Compans，1981 年;Puhl 等人，2021 年;Shen 等人，2019 年;Xiao 等人，2020 年;Lee 和 Fuller，1993 年;Drews 等人，2019 年），被選為構(gòu)建芯片時(shí)測(cè)試的潛在病毒允許細(xì)胞。然而，這些細(xì)胞需要不同的培養(yǎng)條件。BHK-21、MDCK 和 RD 細(xì)胞需要 MEM，而 A549 和 Vero 細(xì)胞需要 DMEM。為了在相同條件下在芯片上培養(yǎng)這些不同的細(xì)胞系，通過使細(xì)胞逐漸適應(yīng)來建立含有 1% FBS 的 DMEM。結(jié)果，所有五種細(xì)胞系在接種后都能粘附在芯片的底物上，并顯示出正常的形態(tài)和活力（圖 3 和圖 4）。

圖 3.在 96 孔板中比較在 MEM 與 DMEM 中培養(yǎng)的五種細(xì)胞系的細(xì)胞形態(tài)和活力，均含有 1% FBS。

圖 4.在芯片上培養(yǎng)多種不同的細(xì)胞系。

3.3. 使用微流控芯片篩選 EV71 允許細(xì)胞的可行性

為了評(píng)估使用細(xì)胞芯片篩選病毒宿主細(xì)胞的可行性，選擇兩種眾所周知的病原體EV71和H1N1作為模型病毒。在正常情況下，當(dāng)在適當(dāng)?shù)?MOI 下感染這些病毒時(shí)，允許培養(yǎng)的細(xì)胞表現(xiàn)出 CPE，例如由于病毒復(fù)制和釋放而呈圓形、收縮或細(xì)胞質(zhì)起泡。

為了證明 EV71、A549、Vero 和 RD 細(xì)胞的典型 CPE，以 1 × 104 個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在 96 孔板中，并以 MOI 為 40 的 EV71 感染。所有三種細(xì)胞類型均表現(xiàn)出細(xì)胞病變變化，其中RD細(xì)胞在感染后24小時(shí)（hpi）表現(xiàn)出最顯著的變化（補(bǔ)充圖S1）。為了模擬用于 EV71 允許細(xì)胞篩選的臨床或現(xiàn)場(chǎng)樣品，將 A549、Vero 和 RD 細(xì)胞以與 96 孔板中相同的細(xì)胞密度接種到芯片上，并以 0.389 和 3.89 × 10?4 的低得多的 MOI 感染 EV71（圖 5）。與未感染病毒的對(duì)照細(xì)胞（補(bǔ)充圖S2）相比，在96孔板或芯片上分別在30（圖5A）和48（圖5D）hpi下培養(yǎng)的RD細(xì)胞上觀察到典型的CPE。盡管 96 孔板中的 Vero 細(xì)胞在 MOI 為 0.389 時(shí)也顯示出病變，但在兩種培養(yǎng)模式下，RD 細(xì)胞在 30 hpi 時(shí)表現(xiàn)出最典型的 CPE（圖 5A）。當(dāng)使用RT-qPCR測(cè)量不同細(xì)胞系中EV71的病毒RNA拷貝數(shù)時(shí)，RD細(xì)胞對(duì)EV71增殖的支持最好，特別是在較低的MOI下（圖5B和E）。具體而言，在MOI為0.389時(shí)，來自96孔板的A549或Vero細(xì)胞培養(yǎng)物中的EV71 RNA拷貝數(shù)大于來自細(xì)胞芯片的拷貝數(shù)（圖5C）。這種差異可能是由于 96 孔板中的感染允許病毒顆粒和靶細(xì)胞上的受體與灌注芯片上的病毒顆粒和受體之間接觸的機(jī)會(huì)更高。相比之下，在MOI為0.000389時(shí)，A549和Vero細(xì)胞沒有觀察到這種差異，這可以通過以下事實(shí)來解釋：在超低MOI下，A549和Vero細(xì)胞中幾乎沒有發(fā)生EV71增殖（圖5F）。在兩種MOI中，RD細(xì)胞對(duì)EV71的增殖效率最高，96孔板和細(xì)胞芯片的EV71 RNA拷貝數(shù)無顯著差異。因此，根據(jù)細(xì)胞芯片培養(yǎng)結(jié)果，可以選擇RD細(xì)胞作為EV71的允許細(xì)胞系。這與RD細(xì)胞用于EV71培養(yǎng)的成熟使用一致，并與我們從96孔板（補(bǔ)充圖S1）的結(jié)果相匹配，表明基于細(xì)胞芯片的允許細(xì)胞篩選可以用作傳統(tǒng)板培養(yǎng)方法的替代品。

圖 5.使用微流控芯片篩選 EV71 允許細(xì)胞的可行性。

此外，考慮到病毒感染后允許的細(xì)胞可能釋放細(xì)胞因子，我們進(jìn)一步測(cè)試了未感染或不太敏感的細(xì)胞系是否會(huì)受到最敏感細(xì)胞系的影響。我們調(diào)整了細(xì)胞系在微流控芯片上的排列順序，并進(jìn)行了篩選實(shí)驗(yàn)（圖6）。結(jié)果表明，無論細(xì)胞系以何種順序培養(yǎng)，RD細(xì)胞仍被“鑒定”為EV71的允許細(xì)胞系，支持允許細(xì)胞對(duì)非敏感或不太敏感的細(xì)胞系的潛在影響不會(huì)干擾使用微流控細(xì)胞芯片篩選病毒允許細(xì)胞的結(jié)果。

圖 6.EV71感染在微流控芯片上以不同排列方式接種的不同細(xì)胞系。

3.4. 使用微流控芯片篩選 H1N1 允許細(xì)胞的可行性

為了比較基于細(xì)胞芯片和傳統(tǒng)基于板的篩選，將 A549、Vero 和 MDCK 細(xì)胞接種在細(xì)胞芯片上或以 1 × 104 個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種到 96 孔板中。流感病毒H1N1的培養(yǎng)需要TPCK處理的胰蛋白酶（TPCK-胰蛋白酶），因此將培養(yǎng)基優(yōu)化為含有2%BSA和2μg/mL TPCK-胰蛋白酶的DMEM（補(bǔ)充圖S3）。首先允許流感病毒 H1N1 以 12.3 的 MOI 感染這些細(xì)胞，以證明 H1N1 的典型 CPE。在24 hpi時(shí)，MDCK細(xì)胞顯示出顯著的CPE，而其他細(xì)胞仍保持正常的細(xì)胞形態(tài)（補(bǔ)充圖S4）。

然后，在96孔板或微流控芯片上培養(yǎng)的細(xì)胞以0.012和0.00012的較低MOI感染H1N1，以模擬臨床或現(xiàn)場(chǎng)樣品進(jìn)行H1N1允許細(xì)胞篩選（圖7）。在MOI為0.012時(shí)，與未感染病毒的對(duì)照細(xì)胞（補(bǔ)充圖S5）相比，在兩種培養(yǎng)模式下（圖7A）下，在72 hpi的MDCK細(xì)胞上觀察到典型的CPE，這與MDCK細(xì)胞系對(duì)EV71允許的知識(shí)一致。然而，在MOI為0.00012時(shí)，沒有一個(gè)細(xì)胞系顯示出明確的CPE（圖7D），這應(yīng)該是由超低MOI引起的。為了進(jìn)一步確認(rèn)流感病毒H1N1可以在通過芯片培養(yǎng)“鑒定”為允許的細(xì)胞中復(fù)制，對(duì)培養(yǎng)物中的流感病毒H1N1 RNA進(jìn)行了定量分析（圖7B和E）。在 MOI 為 0.012 或 0.00012 的 A549、Vero 和 MDCK 細(xì)胞感染流感病毒 H1N1 后，以 72 hpi 收集培養(yǎng)物，并使用帶有流感病毒 H1N1 聚合酶基因探針的 RT-qPCR 進(jìn)行分析。在MOI為0.012時(shí)，病毒在兩種培養(yǎng)模式下在MDCK細(xì)胞中復(fù)制（圖7C）。雖然沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異，但在微流控芯片上培養(yǎng)的細(xì)胞中后代病毒的病毒RNA拷貝數(shù)略高于在96孔板中培養(yǎng)的細(xì)胞的病毒RNA拷貝數(shù)。然而，在MOI為0.00012時(shí)，在細(xì)胞芯片上的MDCK細(xì)胞中僅檢測(cè)到低水平的病毒復(fù)制，而在96孔板的MDCK細(xì)胞中未檢測(cè)到病毒復(fù)制（圖7F），這表明與傳統(tǒng)的基于平板的培養(yǎng)方法相比，細(xì)胞芯片可能對(duì)允許的細(xì)胞篩選更敏感。此外，我們還測(cè)試了未感染或不太敏感的細(xì)胞系是否會(huì)受到最敏感細(xì)胞系的影響。通過調(diào)整微流控芯片上細(xì)胞系的排列順序，我們發(fā)現(xiàn)無論細(xì)胞系以何種順序培養(yǎng)，MDCK細(xì)胞系都是H1N1的允許細(xì)胞系（圖8）。這些結(jié)果進(jìn)一步支持了使用細(xì)胞芯片篩選病毒允許細(xì)胞的可行性。

圖 7.用微流控芯片篩選H1N1允許細(xì)胞的可行性。                                                             圖 8.H1N1感染不同細(xì)胞系以不同排列接種在微流控芯片上。

4. 討論

在這項(xiàng)研究中，已經(jīng)制造了一種用于病毒培養(yǎng)的微流控細(xì)胞芯片，其工作原理如下。將多種候選細(xì)胞系接種在PDMS芯片的腔室中。當(dāng)含有病毒的樣本流過腔室時(shí)，允許病毒的細(xì)胞系將被感染，導(dǎo)致CPE。因此，可以確定新出現(xiàn)的病毒的允許細(xì)胞系，同時(shí)，可以通過分子生物學(xué)技術(shù)培養(yǎng)病毒以進(jìn)行分離和鑒定。

微流控在先進(jìn)材料、制造方法和在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用前景廣闊，顯示出巨大的潛力。在這里，通過使用強(qiáng)大的微流控技術(shù)，我們旨在開發(fā)一種用于病毒培養(yǎng)和分離的快速允許細(xì)胞篩選方法。為了使該方法簡(jiǎn)單而穩(wěn)健，我們應(yīng)用了微流控電池芯片的簡(jiǎn)單設(shè)計(jì)，并通過3D打印制備了帶有PDMS的芯片。芯片上有多個(gè)串聯(lián)的腔室，可以對(duì)病毒允許的細(xì)胞進(jìn)行高通量篩選。此外，微流控細(xì)胞芯片可以集成到定制設(shè)備中，在高水平的生物安全控制下實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化高通量篩選和分離病毒。我們方法的優(yōu)勢(shì)不在于細(xì)胞芯片的制造方式，而在于它將提供下一代病毒分離和鑒定模式，效率更高，研究人員暴露于潛在傳染性樣本的風(fēng)險(xiǎn)更低。事實(shí)上，以前已經(jīng)報(bào)道過使用微流控芯片進(jìn)行病毒感染研究。Warrick等人使用微流控芯片測(cè)量被水泡性口炎病毒感染的宿主細(xì)胞的細(xì)胞基因表達(dá)（Warrick等人，2016）。Guo等人制造了由PDMS層組成的微腔，以監(jiān)測(cè)病毒感染時(shí)的細(xì)胞動(dòng)力學(xué)（Guo等人，2017）。然而，在這些研究中描述的微流控芯片上僅培養(yǎng)了單個(gè)細(xì)胞系，而這里報(bào)道的微流控細(xì)胞芯片實(shí)現(xiàn)了五個(gè)不同細(xì)胞系的同時(shí)培養(yǎng)。為了成為一種強(qiáng)大的細(xì)胞篩選和病毒分離工具，我們芯片上的細(xì)胞系數(shù)量仍有待增加。原則上，可以通過簡(jiǎn)單地增加細(xì)胞芯片上的腔室數(shù)量或設(shè)計(jì)平行芯片并分組或調(diào)整感興趣的細(xì)胞系來擴(kuò)展培養(yǎng)細(xì)胞系的類型。使用細(xì)胞芯片進(jìn)行病毒分離時(shí)要考慮的另一個(gè)問題是，樣本中可能存在兩種或多種類型的病毒，并且在試圖尋找特定傳染病的病原體時(shí)被分離出來。在這種情況下，應(yīng)通過測(cè)序或其他分子生物學(xué)技術(shù)鑒定目標(biāo)病毒。

該細(xì)胞芯片將符合感染性樣本操作中嚴(yán)格的生物安全要求。除了在篩選測(cè)定之前短暫暴露PDMS芯片外，細(xì)胞芯片設(shè)備在完全密封的條件下運(yùn)行，可防止含有傳染性病原體的培養(yǎng)基泄漏。此外，根據(jù)生物安全法規(guī)，該設(shè)備用于培養(yǎng)病毒時(shí)，應(yīng)放置在合格的生物安全柜中。此外，微流控細(xì)胞芯片可以集成到未來符合生物安全協(xié)議的定制設(shè)備中，以便所有步驟（即細(xì)胞接種、病毒感染、灌注、循環(huán)等）都可以在生物安全控制下的完全封閉空間內(nèi)進(jìn)行，這有利于自動(dòng)化操作并降低研究人員暴露的風(fēng)險(xiǎn)。

5. 結(jié)論

綜上所述，通過預(yù)制芯片框架和定制PDMS芯片的快速組裝，制備了一種用于細(xì)胞培養(yǎng)的簡(jiǎn)單微流控芯片。不同的PDMS芯片可以快速定制以滿足病毒識(shí)別需求，并重新組裝到這種微流控芯片中，這將有助于縮短從芯片設(shè)計(jì)到生產(chǎn)的時(shí)間。通過標(biāo)準(zhǔn)化培養(yǎng)條件，實(shí)現(xiàn)了多種常用于病毒增殖的代表性細(xì)胞系的培養(yǎng)。使用兩種模型病毒 EV71 和 H1N1 的感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，微流控芯片系統(tǒng)通過支持在相應(yīng)的已知宿主細(xì)胞系中開發(fā)典型 CPE，在識(shí)別病毒允許細(xì)胞方面效果良好。與傳統(tǒng)的基于平板的病毒培養(yǎng)和分離方法相比，該細(xì)胞芯片系統(tǒng)具有更高的通量和更小的樣品需求。此外，通過與必要的控制模塊或設(shè)備集成，系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)，從而節(jié)省時(shí)間。本文所述的基于細(xì)胞芯片的培養(yǎng)系統(tǒng)為識(shí)別病毒允許的細(xì)胞和分離新出現(xiàn)的病毒提供了一種快速有效的方法，這將有助于對(duì)抗病毒性疾病。此外，這里制造的細(xì)胞芯片還可用于微納米材料的細(xì)胞毒性研究、抗病毒藥物篩選等。

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