按照芯片實(shí)驗(yàn)室工作的一般流程，進(jìn)樣和樣品預(yù)處理是首當(dāng)其沖的兩個(gè)環(huán)節(jié)，它們將原始樣品送入系統(tǒng)轉(zhuǎn)換為適于運(yùn)行的形式，并保證最終樣品處理結(jié)果的質(zhì)量和可靠性。從芯片實(shí)驗(yàn)室概念提出至今，已經(jīng)累積了一整套進(jìn)樣和樣品預(yù)處理技術(shù)，它們是芯片實(shí)驗(yàn)室發(fā)展的重要基礎(chǔ)。

利用芯片平臺(tái)處理樣品，首先需要將樣品引入芯片的樣品處理通道或通道網(wǎng)絡(luò)，該步驟通常稱(chēng)為進(jìn)樣(sample loading)。進(jìn)樣通常又可分為上樣和取樣兩個(gè)步驟。芯片樣品處理通道粗細(xì)與人類(lèi)的毛發(fā)相若，如何將樣品從外部宏觀世界以可控的方式引入微觀通道內(nèi)部一直是芯片實(shí)驗(yàn)室領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)(圖5-1)。

進(jìn)樣是芯片實(shí)驗(yàn)室的關(guān)鍵技術(shù)之一，引入樣品的量、形態(tài)和方式等均會(huì)對(duì)后續(xù)樣品處理產(chǎn)生影響，因芯片體系微小，這種影響有時(shí)甚至是決定性的。穩(wěn)定、可靠的進(jìn)樣是芯片實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)業(yè)化的必要條件之一。

待進(jìn)樣的樣品可存儲(chǔ)于芯片上的儲(chǔ)液池，從儲(chǔ)液池進(jìn)樣快捷，但樣品容量偏低。樣品也可存儲(chǔ)在芯片外，此時(shí)樣品通過(guò)導(dǎo)管進(jìn)入芯片(圖5-2(a))。外置樣品源容量大，可滿足長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)進(jìn)樣。

芯片進(jìn)樣可由電場(chǎng)、注射泵、靜壓力、表面張力等不同的方式驅(qū)動(dòng)(圖5-2 (b))。一般意義上的進(jìn)樣通常針對(duì)液態(tài)樣品，氣態(tài)樣品也可直接進(jìn)樣，固態(tài)樣品在微?；?，經(jīng)過(guò)液/氣流攜帶也可被引入芯片樣品處理通道。

(a) 兩種進(jìn)樣模式示意:()儲(chǔ)液池模式(樣品存儲(chǔ)在芯片儲(chǔ)液池內(nèi)，由儲(chǔ)液池進(jìn)入芯片微通道);(I) 導(dǎo)管模式(樣品存儲(chǔ)在芯片外，由導(dǎo)管引入芯片微通道);(b)四種進(jìn)樣驅(qū)動(dòng)方式示意(I)電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)模式(電極置入微通道兩端的儲(chǔ)液池中，所產(chǎn)生的電場(chǎng)即可驅(qū)動(dòng)微通道中的液體)，(I)注射泵驅(qū)動(dòng)模式，(Ⅲ)靜壓力驅(qū)動(dòng)模式(液體從高液位芯片儲(chǔ)液池流向低液位芯片儲(chǔ)液池)，(IV)表面張力驅(qū)動(dòng)模式(微通道內(nèi)彎曲液面所產(chǎn)生表面張力可作為流體驅(qū)動(dòng)力)

5.1 液態(tài)樣品進(jìn)樣

芯片實(shí)驗(yàn)室處理的對(duì)象是流體，液態(tài)樣品進(jìn)樣是芯片進(jìn)樣的主流，實(shí)際中主要有三種情形:向樣品處理通道內(nèi)引入樣品區(qū)帶，引入樣品液滴和引入持續(xù)樣品流。

5.1.1 區(qū)帶樣品進(jìn)樣

向芯片樣品處理通道內(nèi)引入樣品區(qū)帶是芯片電泳、芯片色譜、芯片電色譜等芯片實(shí)驗(yàn)室重要單元操作實(shí)施的先決條件。樣品區(qū)帶的量、長(zhǎng)度等

指標(biāo)對(duì)于單元操作的結(jié)果有重大影響。如何向通道內(nèi)引入可控樣品區(qū)帶自微流控芯片概念提出以來(lái)一直是一個(gè)研究熱點(diǎn)。

5.1.1.1 單通道輔助進(jìn)樣

經(jīng)樣品源向芯片樣品處理通道內(nèi)輸入樣品區(qū)帶通常需要其他手段輔助，最簡(jiǎn)單的方法是設(shè)置一條輔助通道，該法被稱(chēng)為單通道輔助進(jìn)樣，通常分兩步，上樣和取樣(圖5-3)。

圖5-3 單通道輔助進(jìn)樣

(a)進(jìn)樣過(guò)程示意和對(duì)應(yīng)的熒光顯微照片:(I)上樣:將樣品從樣品源引入輔助通道，在十字交叉口處形成一區(qū)帶;(II)、(III)取樣:將十字交叉口處區(qū)帶引入樣品處理通道，通過(guò)十字交叉口的幾何尺寸控制區(qū)帶的長(zhǎng)度和量;(b)典型的單通道輔助進(jìn)樣芯片設(shè)計(jì)

單通道輔助進(jìn)樣按上樣和取樣的驅(qū)動(dòng)力的不同可分為完全電動(dòng)單通道輔助進(jìn)樣、完全壓力單通道輔助進(jìn)樣和壓力電動(dòng)單通道輔助進(jìn)樣等幾種。

完全電動(dòng)單通道輔助進(jìn)樣

完全電動(dòng)單通道輔助進(jìn)樣簡(jiǎn)稱(chēng)電動(dòng)進(jìn)樣，指的是一種僅以電動(dòng)力(包括電泳力和電滲力)為驅(qū)動(dòng)力，通過(guò)電壓切換，在十字交叉處形成樣品區(qū)帶并將其引入樣品處理通道的方法。電動(dòng)進(jìn)樣操作簡(jiǎn)便，易于實(shí)施，是目前主流的單通道輔助進(jìn)樣技術(shù)。

依據(jù)電壓施加策略的不同，這種進(jìn)樣方式又可分為簡(jiǎn)單進(jìn)樣、懸浮進(jìn)樣、壓縮進(jìn)樣和門(mén)進(jìn)樣等(圖5-4)。

圖5-4 各種電動(dòng)進(jìn)樣方法原理示意

(a)簡(jiǎn)單進(jìn)樣;(b)懸浮進(jìn)樣;(c)壓縮進(jìn)樣;(d) 門(mén)進(jìn)樣存儲(chǔ)不同溶液的芯片儲(chǔ)液池，1.樣品池，2.樣品廢液池，3.緩沖液池，4.緩沖液廢液池

簡(jiǎn)單進(jìn)樣和懸浮進(jìn)樣方法上樣和取樣都只涉及單方向電場(chǎng)，操作簡(jiǎn)單，在預(yù)實(shí)驗(yàn)中較常用(懸浮指的是電極不施加電壓的狀態(tài))，壓縮進(jìn)樣方法涉及多方向電場(chǎng)，可較好地控制樣品區(qū)帶的量和長(zhǎng)度，在實(shí)際中使用較多(圖5-3(a)熒光照片所示即為壓縮進(jìn)樣過(guò)程)。門(mén)進(jìn)樣方法可向樣品處理通道內(nèi)連續(xù)輸入?yún)^(qū)帶，缺點(diǎn)在于輸入?yún)^(qū)帶的形態(tài)不甚規(guī)則。所有電動(dòng)進(jìn)樣方法均服從基爾霍夫定律，即在任一時(shí)刻，各段流路內(nèi)的電場(chǎng)強(qiáng)度的矢量和等于零。在圖5-5所示的十字芯片中，基爾霍夫定律可表達(dá)為E1+E3+E2+E4=0。

電動(dòng)進(jìn)樣的主要缺點(diǎn)是其存在一種進(jìn)樣歧視效應(yīng)，指的是一種因樣品中各組分電動(dòng)性質(zhì)相異而導(dǎo)致樣品區(qū)帶不能代表實(shí)際樣品組成的現(xiàn)象，其具體機(jī)理因進(jìn)樣類(lèi)型而異且在上樣和取樣階段同時(shí)存在。在上樣階段，門(mén)進(jìn)樣因進(jìn)樣量與上樣時(shí)間有關(guān)，歧視效應(yīng)發(fā)生的機(jī)理為，在相同進(jìn)樣時(shí)間內(nèi)，因不同組分的電動(dòng)淌度相異，淌度大的組分進(jìn)樣量大，淌度小的組分進(jìn)樣量小，是一種淌度電歧視。而對(duì)簡(jiǎn)單進(jìn)樣、懸浮進(jìn)樣和壓縮進(jìn)樣而言，理論上只要上樣時(shí)間足夠長(zhǎng)，保證所有組分均通過(guò)十字交叉口則上述淌度電歧視效應(yīng)可避免，但研究表明上樣過(guò)程中溶液離子強(qiáng)度的變化和因電極附近緩沖液的電解所產(chǎn)生的流體系統(tǒng)pH值漂移也可誘導(dǎo)一定的歧視效應(yīng)。較之上樣階段，對(duì)取樣階段電歧視的研究則相對(duì)滯后，目前了解的情況是這種電歧視與樣品組分分子所帶電荷的種類(lèi)及上樣通道與分離通道的寬度比有關(guān)。

此外，門(mén)進(jìn)樣除存在淌度電歧視外，還存在彎角電歧視，因此不推薦其作為復(fù)雜樣品定量分析的進(jìn)樣方法。彎角電歧視指的是由于樣品各組分電動(dòng)淌度不一致，使其自身在經(jīng)過(guò)十字交叉時(shí)因轉(zhuǎn)彎半徑不一致所引起的歧視效應(yīng)。

完全壓力單通道輔助進(jìn)樣

僅利用壓力將樣品區(qū)帶引入樣品處理通道的方法稱(chēng)為完全壓力單通道輔助進(jìn)樣，簡(jiǎn)稱(chēng)壓力進(jìn)樣(圖5-6)。

圖5-6壓力進(jìn)樣方法原理示意

(a) 預(yù)備狀態(tài)、(b)上樣，(c)取樣，通過(guò)(b)、(c)之間的反復(fù)切換可實(shí)現(xiàn)連續(xù)進(jìn)樣

壓力作用下流體的行為與樣品組成、管壁帶電狀況等基本無(wú)關(guān)，因此壓力進(jìn)樣方法所引入的樣品區(qū)帶在很大程度上可代表樣品中各組分的真實(shí)組成，但向微通道內(nèi)施加壓力操作比較繁雜，所需設(shè)備也較精密和昂貴，有一定的技術(shù)門(mén)檻，此外，壓力進(jìn)樣方法并不涉及電場(chǎng)，因此，完全壓力單通道輔助進(jìn)樣方法的實(shí)際應(yīng)用面較狹窄，主要集中于芯片液相色譜類(lèi)操作。

壓力電動(dòng)單通道輔助進(jìn)樣

壓力電動(dòng)單通道輔助進(jìn)樣是一種上樣驅(qū)動(dòng)力為壓力，取樣驅(qū)動(dòng)力為電動(dòng)力的進(jìn)樣方法，簡(jiǎn)稱(chēng)壓力電動(dòng)進(jìn)樣。典型案例是作者課題組開(kāi)發(fā)出的一種靜壓力電動(dòng)進(jìn)樣方法(圖5-7)。

圖5-7靜壓力電動(dòng)進(jìn)樣方法(示意圖和熒光顯微照片)

壓力電動(dòng)進(jìn)樣方法因采用壓力上樣而使樣品區(qū)帶能夠代表樣品中各組分的真實(shí)組成，又因采用電動(dòng)取樣而與芯片電泳、電色譜等重要芯片實(shí)驗(yàn)室單元操作兼容。類(lèi)似于完全壓力進(jìn)樣，壓力電動(dòng)進(jìn)樣的推廣受限于壓力上樣的技術(shù)門(mén)檻，但因產(chǎn)生壓力的方式多種多樣，該法在一段時(shí)期內(nèi)是科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，除靜壓力電動(dòng)進(jìn)樣方法外，其它種類(lèi)的壓力電動(dòng)進(jìn)樣方法還有注射泵致壓力電動(dòng)進(jìn)樣[7]、氣動(dòng)微泵致壓力電動(dòng)進(jìn)樣等。

樣品池、緩沖液池、緩沖液廢液池和樣品廢液池內(nèi)溶液的體積分別為13、10、10和2μL。(a)預(yù)備狀態(tài)(施加電場(chǎng)使緩沖液從緩沖液池流向樣品廢液池，形成一個(gè)“門(mén)”，樣品在靜壓力作用下從樣品池流向樣品廢液池，在“門(mén)”的作用下，樣品不能進(jìn)入樣品處理通道);(b)上樣(將緩沖液池和樣品廢液池切換為懸浮狀態(tài)，樣品即在樣品池與緩沖液廢液池間的靜壓力作用下進(jìn)入樣品處理通道);(c)取樣(上樣30s后，恢復(fù)預(yù)備狀態(tài)電壓設(shè)置，一段樣品區(qū)帶便被導(dǎo)入至樣品處理通道);(d)上樣熒光顯微照片;(e)取樣熒光顯微照片

5.1.1.2 多通道輔助進(jìn)樣

設(shè)置多條輔助通道，向樣品處理通道內(nèi)輸入樣品區(qū)帶的方法稱(chēng)為多通道輔助進(jìn)樣。典型案例包括雙十字靜壓力進(jìn)樣方法[1(圖5-8)、雙十字電動(dòng)進(jìn)樣法、多T電動(dòng)進(jìn)樣法等。

圖5-8所示即為作者課題組開(kāi)發(fā)的雙十字靜壓力電動(dòng)進(jìn)樣法。在原有十字交叉結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上增加了一個(gè)十字交叉結(jié)構(gòu)，雙十字間距離十分接近，從幾微米至幾十微米不等。上樣時(shí)，樣品廢液池置空，其余儲(chǔ)液池內(nèi)則加入一定體積的溶液，在靜壓力驅(qū)動(dòng)下，樣品從樣品池1經(jīng)橋流入樣品廢液池，待兩個(gè)十字交叉口處充滿樣品后，在輔助通道2和分離通道內(nèi)同時(shí)施加相同大小的電場(chǎng)實(shí)施取樣，分離通道十字交叉口內(nèi)的樣品在電場(chǎng)作用下流入分離通道，形成樣品區(qū)帶，而來(lái)源于樣品池的靜壓力樣品流則被電場(chǎng)經(jīng)十字交叉口轉(zhuǎn)入輔助通道2，不會(huì)流入分離通道干擾隨后的電泳分析，如圖5-8 (a)所示。

由于兩條輔助通道的設(shè)置，雙十字靜壓力進(jìn)樣方法可對(duì)樣品區(qū)帶實(shí)施精細(xì)調(diào)節(jié)，實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)于羅丹明123樣品，在一定范圍內(nèi)，進(jìn)樣量和所加旁路電場(chǎng)大小呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，如圖5-8(b)所示。這種線性關(guān)系在熒光素納樣品上也得到證實(shí)。

圖5-8 雙十字靜壓力進(jìn)樣法

在圖5-9(a) 和(b)中，其進(jìn)樣所需的電極數(shù)可被降至兩個(gè)。該法的缺點(diǎn)是芯片微通道網(wǎng)絡(luò)設(shè)計(jì)稍顯復(fù)雜。

電極數(shù)目與芯片電泳儀的搭建難度、成本，電泳實(shí)驗(yàn)操作難度關(guān)系密切。芯片電泳儀所需電極的最小數(shù)目為二。因此，兩電極雙十字靜壓力進(jìn)樣法可將芯片電泳儀的搭建難度和成本降至最低，同時(shí)降低電泳實(shí)驗(yàn)操作難度，便于芯片電泳技術(shù)的推廣和普及。

兩電極雙十字靜壓力進(jìn)樣法還可降低陣列芯片電泳進(jìn)樣所需電極數(shù)，最低也可降至兩個(gè)(圖5-9 (c))。

圖5-9 雙十字靜壓力進(jìn)樣方法對(duì)電極數(shù)目的減小作用

(a)雙十字靜壓力進(jìn)樣方法:由四電極到兩電極;(b)基于兩電極雙十字靜壓力進(jìn)樣方法的蛋白質(zhì)電泳譜圖;(c)兩種基于兩電極進(jìn)樣設(shè)計(jì)的陣列電泳芯片及對(duì)應(yīng)的染料陣列電泳譜圖

5.1.1.3 激光輔助進(jìn)樣

若樣品帶有熒光且采用熒光法檢測(cè)，可不設(shè)輔助通道，而利用強(qiáng)激光對(duì)樣品的漂白作用直接在分離通道內(nèi)形成樣品區(qū)帶。該法實(shí)質(zhì)上是一種門(mén)進(jìn)樣，“門(mén)"為強(qiáng)激光束。如圖5-10所示。大功率的激光束被分光器分為能量不同的兩束，其中能量大(75-750mW)的作為“門(mén)”光束被聚焦到通道上游靠近樣品池處，能量小(2mW)的光束則被聚焦到通道下游作為檢測(cè)光束。在上樣開(kāi)始前，樣品在通道兩端電場(chǎng)的作用下持續(xù)流出樣品池，在通道上游流經(jīng)大能量“門(mén)”光束時(shí)，經(jīng)其漂白變?yōu)榉菬晒饣衔铮⑴c緩沖液一起流經(jīng)檢測(cè)光束，在電泳譜圖上形成基線。這種情形等效于“門(mén)”處于關(guān)閉狀態(tài)。上樣時(shí)，由一光閘擋住"門(mén)”光束，“門(mén)"隨即開(kāi)啟，一段熒光樣品因未被漂白而進(jìn)入下游分離通道，形成樣品區(qū)帶?！伴T(mén)”開(kāi)啟的時(shí)間越長(zhǎng)，進(jìn)樣量越大。類(lèi)似于前述幾種門(mén)進(jìn)樣方法，光門(mén)進(jìn)樣同樣可連續(xù)進(jìn)樣且速度較快，此外芯片設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，易于陣列化，但因激光不能完全漂白熒光化合物而導(dǎo)致其基線噪音較大，檢測(cè)限偏高。

圖5-10 激光輔助進(jìn)樣(a) 原理示意;(b)典型的連續(xù)進(jìn)樣譜圖

5.1.2 液滴樣品進(jìn)樣

液體可以以不連續(xù)微小液滴的形式存在于與之不相溶的另一種液體中，這種兩相體系稱(chēng)之為乳液(emulsion)。乳液既與人類(lèi)的生活密切相關(guān)，又是科學(xué)研究的一個(gè)重要平臺(tái)。日常用的化妝品很多便以乳液狀態(tài)存在，而乳液中微小的液滴又可以支撐多種生化研究，甚至有科學(xué)家提出了“液滴實(shí)驗(yàn)室”的概念。如何向芯片樣品處理通道內(nèi)引入液滴成為芯片進(jìn)樣領(lǐng)域研究的一個(gè)熱門(mén)課題。

以連續(xù)液滴為特征的微流控芯片稱(chēng)為液滴微流控芯片(圖5-11)。液滴微流控芯片是芯片實(shí)驗(yàn)室領(lǐng)域的一個(gè)重要分支。本書(shū)第8章將對(duì)該分支做詳細(xì)介紹。

當(dāng)油相和水相流動(dòng)速率之比為合適數(shù)值時(shí)，從T型交叉口處可以向樣品處理通道連續(xù)輸出液滴;當(dāng)樣品處理通道為蛇形時(shí)，液滴在遷移時(shí)內(nèi)部存在一個(gè)自動(dòng)混合過(guò)程

5.1.3 連續(xù)樣品進(jìn)樣

將液體持續(xù)導(dǎo)入至樣品處理通道稱(chēng)為為連續(xù)樣品進(jìn)樣。連續(xù)樣品進(jìn)樣是芯片有機(jī)合成、液液萃取、細(xì)胞培養(yǎng)等領(lǐng)域的一項(xiàng)基礎(chǔ)技術(shù)。理論上，只要樣品源與微通道連通，輔以持續(xù)的驅(qū)動(dòng)力，就可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)樣品進(jìn)樣。實(shí)際中，一個(gè)大的挑戰(zhàn)在于如何方便快捷地實(shí)現(xiàn)持續(xù)、穩(wěn)定、自動(dòng)化的連續(xù)樣品進(jìn)樣。

作者所在實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)出一種基于”表面張力-蒸發(fā)”平衡效應(yīng)的連續(xù)進(jìn)樣方法(圖5-12)，該法在不需要芯片外部設(shè)備，控制軟件和動(dòng)力源的條

件下實(shí)現(xiàn)了持續(xù)、穩(wěn)定、自動(dòng)化的連續(xù)樣品進(jìn)樣，而且進(jìn)樣裝置的體積和成本都極小，操作也無(wú)需專(zhuān)業(yè)技巧。該進(jìn)樣方法很可能在家庭化的芯片實(shí)驗(yàn)室中得到廣泛應(yīng)用，對(duì)芯片實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)業(yè)化也有一定的促進(jìn)作用。

圖5-12 基于“表面張力-蒸發(fā)"平衡效應(yīng)的連續(xù)進(jìn)樣方法

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