2.2.4 單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

 (1)細(xì)菌培養(yǎng)與預(yù)處理

 在厭氧箱內(nèi)進(jìn)行平板劃線，挑選 5 個(gè)單菌落于 3 mL 液體培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行活化過(guò)夜，過(guò)夜培養(yǎng)所得的菌液與培養(yǎng)基按 1∶100 轉(zhuǎn)接至 120 mL培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)后期。用封膜封住離心管口后，將菌液以 5 000 r/min 離心 10 min。倒出上清液，重懸沉淀再次離心，以 5 000 r/min 離心5 min。使用含 0.01 g/mL F-127 的上清液重懸菌體，渦旋混勻。其中，固體培養(yǎng)基為 LB 瓊脂(E. coli)和 BHI 瓊脂(B. fragilis)，液體培養(yǎng)基為RDM+glucose (E. coli)和 BHIS (B. fragilis)。

 (2)細(xì)菌裝載

 將混勻的濃縮菌液注入芯片，采用無(wú)塵膠帶貼上芯片出入口，將芯片固定在培養(yǎng)皿內(nèi)，封膜，以 2 000～2 500 r/min 離心 5 min。在厭氧工作站內(nèi)將芯片固定于自制厭氧培養(yǎng)盒內(nèi)，密封好后架設(shè)到顯微鏡上，連接氣路和液路。

 (3)單細(xì)胞延時(shí)拍攝

 待厭氧盒內(nèi)氧氣指示劑保持粉色，使用 100×油鏡觀察熒光場(chǎng)——若無(wú)可見(jiàn)熒光激發(fā)(E. coli)，則開(kāi)始選點(diǎn)進(jìn)行延時(shí)拍攝。實(shí)驗(yàn)完成后，使用自主研發(fā)的相關(guān)軟件進(jìn)行圖像處理與數(shù)據(jù)分析。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 厭氧程度評(píng)估

 本實(shí)驗(yàn)體系的關(guān)鍵點(diǎn)在于單細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)厭氧條件的維持，這里從培養(yǎng)氣體氛圍與細(xì)胞學(xué)水平證據(jù)(熒光蛋白激發(fā))來(lái)進(jìn)行評(píng)估。

3.1.1 氣體氛圍

 厭氧培養(yǎng)盒在實(shí)驗(yàn)中會(huì)持續(xù)通入?yún)捬趸旌蠚?/span>——95% N2＋5% CO2，以營(yíng)造并長(zhǎng)期維持盒內(nèi)厭氧環(huán)境。其中，N2 為模擬空氣主要成分，生理意義不大，一定濃度的 CO2 為細(xì)菌正常生長(zhǎng)所必需。該氣體組成與常用的厭氧工作站基本相同，只是缺少 H2，而 H2 在厭氧工作站的主要作用是便于在催化裝置的作用下與 O2 反應(yīng)生成H2O 以達(dá)到除氧的目的，但由于厭氧培養(yǎng)盒并不像厭氧工作站一樣體積巨大，需要時(shí)常取放實(shí)驗(yàn)物品或者進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作而出現(xiàn) O2 進(jìn)入的風(fēng)險(xiǎn)；反之，厭氧培養(yǎng)盒具有優(yōu)秀的氣密性，并且在整個(gè)厭氧培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中一直維持密封，整體組裝也在厭氧工作站內(nèi)進(jìn)行，故無(wú)需除氧。

 實(shí)驗(yàn)中，厭氧培養(yǎng)盒內(nèi)放置有氧氣指示劑，當(dāng)盒內(nèi)氣體氛圍達(dá)到厭氧狀態(tài)時(shí)，氧氣指示劑會(huì)維持粉色(圖 2)，表明此時(shí)厭氧培養(yǎng)盒內(nèi)氣體中O2 濃度低于檢測(cè)下限(≤0.1%)。這種狀態(tài)會(huì)在厭氧盒密封并持續(xù)通入?yún)捬趸旌蠚鈺r(shí)長(zhǎng)期維持，只有在實(shí)驗(yàn)中切換所通入的氣體，將厭氧混合氣換成壓縮空氣時(shí)，指示劑才會(huì)較快地變?yōu)樗{(lán)紫色(超過(guò)檢測(cè)上限 0.5%)，表明厭氧培養(yǎng)盒內(nèi)氣體中的氧氣濃度迅速提升至與空氣相同。

圖 2 培養(yǎng) 48 h 后厭氧培養(yǎng)裝置內(nèi)氧氣指示劑

3.1.2 細(xì)胞水平

在細(xì)胞學(xué)水平，本實(shí)驗(yàn)采用熒光蛋白作為嚴(yán)格厭氧指示劑。熒光蛋白基因位于細(xì)菌染色體上，屬于組成型表達(dá)基因，這意味著熒光蛋白在穩(wěn)態(tài)生長(zhǎng)的細(xì)菌細(xì)胞中始終處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。而作為常規(guī)的熒光蛋白，其成熟發(fā)光除了特定光激發(fā)之外，還有一個(gè)基礎(chǔ)條件就是氧氣的存在，除非是特定改造專門適用于厭氧環(huán)境激發(fā)的熒光蛋白。

如圖 3(d)所示，在有氧培養(yǎng)下，微流控芯片中細(xì)菌細(xì)胞表達(dá)的熒光蛋白受激發(fā)產(chǎn)生明顯的熒光；而在厭氧培養(yǎng)下，雖然對(duì)明場(chǎng)延時(shí)拍攝圖片的分析表明細(xì)菌細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定(圖 4(b)，左半部分)，但是細(xì)胞中的熒光蛋白在相應(yīng)波長(zhǎng)激發(fā)光激發(fā)下，并無(wú)明顯的可見(jiàn)熒光產(chǎn)生(圖 3(b)，LUTs 打開(kāi)增強(qiáng)敏感度，故視野并非黑白)，說(shuō)明此時(shí)細(xì)胞內(nèi)氧氣濃度不足以保證熒光蛋白成熟而受激發(fā)光。Hansen 等研究表明，1×10－7 濃度的溶解氧足以使熒光蛋白受激發(fā)產(chǎn)生熒光，而2.5×10－8 濃度的溶解氧則不足以支持熒光蛋白受激發(fā)而發(fā)光。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在厭氧培養(yǎng)盒持續(xù)通入?yún)捬趸旌蠚膺M(jìn)行厭氧培養(yǎng)時(shí)，微流控芯片內(nèi)溶解氧濃度至少低于 1×10－7，達(dá)到了優(yōu)秀的嚴(yán)格厭氧程度，完全滿足兼性厭氧菌與嚴(yán)格厭氧菌的厭氧培養(yǎng)，實(shí)際上 0.1% 的氧氣組成已不會(huì)對(duì)一些嚴(yán)格厭氧菌的正常生長(zhǎng)產(chǎn)生影響。

圖 3 大腸桿菌厭氧及有氧條件下明場(chǎng)相差及對(duì)應(yīng)熒光場(chǎng)圖像

圖 4 芯片內(nèi)細(xì)菌細(xì)胞在嚴(yán)格厭氧條件下穩(wěn)定生長(zhǎng)與分裂

3.2 細(xì)菌單細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)

 在單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)完成后，采用自主研發(fā)的分析程序進(jìn)行圖像分析與數(shù)據(jù)處理。通過(guò)對(duì)大量單細(xì)胞的生長(zhǎng)速率進(jìn)行分析可知(圖 4)：對(duì)于嚴(yán)格厭氧菌(B. fragilis)，此實(shí)驗(yàn)方法可以保證其長(zhǎng)期穩(wěn)定地進(jìn)行生長(zhǎng)與分裂；對(duì)于兼性厭氧菌 (E. coli)，此實(shí)驗(yàn)方法既可以提供厭氧環(huán)境確保厭氧穩(wěn)定生長(zhǎng)，又可以將通入的厭氧混合氣改為空氣使其實(shí)現(xiàn)常氧生長(zhǎng)。

4 結(jié)果與討論

 當(dāng)下對(duì)細(xì)菌生理學(xué)的研究越來(lái)越關(guān)注單細(xì)胞的細(xì)胞異質(zhì)性，如細(xì)菌群體中基因回路的動(dòng)態(tài)表達(dá)、細(xì)胞生理狀態(tài)對(duì)抗生素的敏感性、對(duì)細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生過(guò)程中起重要作用的持留性細(xì)胞等。除了方興未艾的微生物單細(xì)胞基因組和轉(zhuǎn)錄組研究外，往往僅采用傳統(tǒng)的群體分批培養(yǎng)方法，而這在研究的時(shí)空“分辨率”上是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的?；谖⒘骺匦酒膯渭?xì)胞技術(shù)為研究細(xì)胞異質(zhì)性提供了可能，這些方法中比較重要的一大類就是基于高分辨率顯微鏡的延時(shí)拍攝技術(shù)。對(duì)于在常氧條件下進(jìn)行常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)，已經(jīng)有許多相關(guān)培養(yǎng)方法，包括基于瓊脂糖平板培養(yǎng)、基于微流控芯片培養(yǎng)等，其中后者能夠在保證穩(wěn)定生長(zhǎng)分裂前提下，實(shí)現(xiàn)上百代細(xì)菌的單細(xì)胞譜系追蹤，但對(duì)于厭氧條件下的單細(xì)菌長(zhǎng)期培養(yǎng)的研究甚少。

 厭氧菌在自然界廣泛存在，而且人體腸道本就是一種厭氧環(huán)境?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為腸道微生物對(duì)人類的健康具有很大的影響，如瘧疾、肥胖、糖尿病、癌癥的免疫應(yīng)答、神經(jīng)(腦腸軸)等，甚至有望基于腸道微生物進(jìn)行個(gè)性化醫(yī)療?；诖?，在進(jìn)行單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要考慮到厭氧這一條件對(duì)細(xì)菌細(xì)胞生理的影響。針對(duì)以上需求，需要開(kāi)發(fā)一種對(duì)培養(yǎng)環(huán)境氧氣氛圍有著嚴(yán)格控制的實(shí)驗(yàn)裝置。無(wú)論是瓊脂糖平板培養(yǎng)還是微流控芯片培養(yǎng)，在不需要控制氧氣組成比例的前提下，所需實(shí)驗(yàn)空間都不大，可以便捷地與商業(yè)化顯微鏡標(biāo)本夾相結(jié)合使用。但是，目前商業(yè)顯微鏡移動(dòng)平臺(tái)與細(xì)胞培養(yǎng)裝置并不能營(yíng)造厭氧環(huán)境，因?yàn)檫@需要額外提供具有優(yōu)秀氣密性的培養(yǎng)裝置。這種裝置需能夠同時(shí)容納單細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境與液體培養(yǎng)基，在裝置外還需要相應(yīng)的氣體調(diào)節(jié)與維持系統(tǒng)，最后為了方便實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的實(shí)時(shí)采集、提高數(shù)據(jù)可信度、降低實(shí)驗(yàn)復(fù)雜性、提高方法通用性，往往需要在設(shè)計(jì)時(shí)就考慮到培養(yǎng)裝置與顯微成像系統(tǒng)的合理適配。

 目前涉及到厭氧條件的細(xì)菌單細(xì)胞方法的相關(guān)報(bào)道并不多，尤其是能夠直接與顯微延時(shí)拍攝相結(jié)合的方法只有基于原有設(shè)計(jì)——在瓊脂糖平板外添加密封裝置并通入?yún)捬趸旌蠚?，以此?shí)現(xiàn)對(duì)一種厭氧的脫硫弧菌(Desulfovibrio Vulgaris Hildenborough)的培養(yǎng)。此外，借此研究了可逆的低濃度氧氣暴露對(duì)細(xì)胞分裂的影響。此方法由于是固體平板培養(yǎng)，存在營(yíng)養(yǎng)消耗的影響，難以完美地保持穩(wěn)定生長(zhǎng)，而且所采集的數(shù)據(jù)量較少、難以追蹤單細(xì)胞譜系。雖如文中所述，培養(yǎng)時(shí)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)熒光蛋白無(wú)法受激發(fā)發(fā)出熒光，以此論證其實(shí)驗(yàn)裝置的厭氧程度，但是針對(duì)“無(wú)熒光”這一關(guān)鍵要素并未提供實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持。而實(shí)際上有研究表明，培養(yǎng)氣體氛圍中 0.1% 的氧氣就足以滿足熒光蛋白受激發(fā)光所需，在此氧氣濃度下即便是嚴(yán)格厭氧菌，由于其對(duì)氧氣有一定的耐受性，也可正常生長(zhǎng)，故僅有嚴(yán)格厭氧菌生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不能說(shuō)明其實(shí)驗(yàn)裝置厭氧程度很高。

 本文所描述的細(xì)菌單細(xì)胞實(shí)時(shí)觀測(cè)系統(tǒng)主要?jiǎng)?chuàng)新之處在于使用了一種自主設(shè)計(jì)的厭氧培養(yǎng)裝置。它是由 3D 打印和數(shù)控機(jī)床加工而來(lái)，內(nèi)部承載微流控芯片和液體培養(yǎng)基，進(jìn)行組裝密封后，具有優(yōu)異的氣密性：氧氣指示劑達(dá)到測(cè)量下限(0.1%)，而細(xì)菌內(nèi)熒光蛋白受激發(fā)無(wú)明顯可見(jiàn)亮光，進(jìn)一步證明細(xì)胞培養(yǎng)基中溶解氧濃度低于1×10－7。該裝置可以適配商業(yè)化顯微鏡的適配器，又與氣體調(diào)節(jié)系統(tǒng)相連，后者為裝置內(nèi)部持續(xù)通入?yún)捬鯕怏w，在負(fù)壓的驅(qū)動(dòng)下，新鮮液體培養(yǎng)基持續(xù)不斷地為細(xì)菌細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)，最終能夠確保芯片內(nèi)所培養(yǎng)的細(xì)菌細(xì)胞在長(zhǎng)期穩(wěn)定的嚴(yán)格厭氧環(huán)境下進(jìn)行生長(zhǎng)與分裂(前提是細(xì)菌本身能夠在厭氧環(huán)境下生長(zhǎng))。本文所開(kāi)發(fā)的實(shí)驗(yàn)裝置及相應(yīng)的整套實(shí)驗(yàn)流程為嚴(yán)格厭氧條件下的細(xì)菌生理學(xué)研究提供了有力的技術(shù)支持。同時(shí)，由于整個(gè)實(shí)驗(yàn)裝置出色的氣密性，除了嚴(yán)格厭氧微生物培養(yǎng)，還可以定量化探究不同氣體組成對(duì)特定微生物生長(zhǎng)的影響。但本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)目前只能使用單一培養(yǎng)基進(jìn)行微生物培養(yǎng)，尚不能滿足一些需要切換培養(yǎng)基的特殊實(shí)驗(yàn)需求，希望未來(lái)的研究能對(duì)此進(jìn)行優(yōu)化。

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