當下微生物研究存在兩個趨勢，一是隨著大量腸道微生物相關研究的開展，研究者們越來越認識到腸道微生物尤其是大量厭氧菌與人類健康息息相關，因為腸道本身在某種程度上也屬于厭氧環(huán)境，故對腸道細菌的細胞生理學研究需要建立在厭氧培養(yǎng)環(huán)境的基礎之上；二是僅依靠經(jīng)典的微生物群體培養(yǎng)方法已經(jīng)難以滿足對細胞異質性的研究，需要發(fā)展多種方法在單細胞水平進行細菌生理學研究，以此深入研究被細胞群體所掩蓋而被研究者忽略的生理規(guī)律。該研究開發(fā)了一種微生物在厭氧條件下的培養(yǎng)方法，包括相關培養(yǎng)裝置設計與相應的實驗方法流程，在穩(wěn)定維持培養(yǎng)環(huán)境嚴格厭氧程度的基礎上，使用微流控芯片對細菌進行長時間的單細胞培養(yǎng)，同時結合高分辨率顯微鏡延時成像技術，在培養(yǎng)的同時實現(xiàn)對生長動態(tài)的實時觀測與數(shù)據(jù)采集。該方法為細菌細胞在厭氧條件下的單細胞分析提供了有力的技術支持。

 近年來，得益于 DNA 測序技術的不斷迭代優(yōu)化，微生物組研究取得了蓬勃發(fā)展。微生物培養(yǎng)方法是微生物相關研究的絕對基礎，是不可繞開的關鍵一環(huán)。傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法包括選擇培養(yǎng)法、平板單克隆培養(yǎng)法、基于密度/細胞尺寸篩選法和有限稀釋法等，均為微生物實驗室的常用基礎方法。微生物學家通過各種培養(yǎng)方法能夠獲得特定細胞株系的純培養(yǎng)，進而為各種細胞生理學實驗提供準確而充足的研究對象。但由于某些微生物相關培養(yǎng)方法的缺失，大大阻礙了研究者對其一些基本屬性的認知，進而影響到相關生態(tài)以及生物學現(xiàn)象的研究。

傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)方法所得到的純培養(yǎng)物，理論上應是來源于同一菌株，幾乎不存在明顯的遺傳變異，通過對其進行測量能夠獲得許多生理學參數(shù)，包括生長速率、死亡率、細胞尺寸分布和基因表達強度等，也能夠獲得類似Monod 方程這樣對工業(yè)生產(chǎn)有著一定指導意義的經(jīng)驗公式。而隨著對細胞生理狀態(tài)噪聲與隨機波動相關研究的逐漸深入，研究者們越來越意識到細胞異質性的存在與重要性，即從某種角度來講每個單細胞都可能與其他細胞有所區(qū)別。若要對細菌進行單細胞水平的培養(yǎng)與研究，則傳統(tǒng)的群體培養(yǎng)方法已不能滿足要求，需要開發(fā)新的實驗培養(yǎng)技術。

在細菌單細胞水平進行生理學研究的重要技術手段之一是利用基于微流控技術的高分辨顯微鏡延時拍攝方法。其中，微流控技術可以實現(xiàn)單細胞培養(yǎng)，并且有著高度的可設計性和對實驗條件的可控性；而顯微鏡延時拍攝方法則是在不影響細胞生理活動的前提下，實時采集各種參數(shù)，與“下一代細菌生理學技術”的理念高度符合。目前相關技術的報道仍主要集中于常規(guī)件的有氧培養(yǎng)，對于與人類健康息息相關的大量厭氧菌與兼性厭氧菌的厭氧生理學的研究則相對較少。該技術的主要難點在于既要確保培養(yǎng)裝置的氣密性，又要將整個培養(yǎng)系統(tǒng)(包括微流控裝置、氣體控制裝置等)與相關商業(yè)化顯微鏡進行適配。此外，由于厭氧條件下細菌生長相對較慢，需要確保整個系統(tǒng)能夠長期穩(wěn)定的運行。

本研究提供了一種厭氧微生物培養(yǎng)與實時觀測裝置。該裝置包括：底座、上蓋、微流控芯片和培養(yǎng)液儲存室。其中，培養(yǎng)裝置上蓋水平面上設有亞克力板或玻璃板視窗，與微流控芯片底部蓋玻片相對設置，便于顯微成像；培養(yǎng)基儲液池上設有出液孔，可與微流控芯片相連為細胞培養(yǎng)提供充足的營養(yǎng)；培養(yǎng)裝置上蓋的側壁上設有氣體入口、氣體出口和出液口，以便維持培養(yǎng)裝置內的厭氧氛圍、氣壓穩(wěn)定以及液體的流通。該裝置具有優(yōu)異的氣密性，能夠為厭氧微生物提供長時間穩(wěn)定的厭氧氣體氛圍且氣體氛圍可控；同時可以滿足高通量、大范圍多位點采樣，高放大倍數(shù)拍攝等實驗需求。

2 材料與方法

2.1 實驗方法

2.1.1 微流控芯片的設計

 本實驗所使用的微流控芯片被稱為母細胞芯片(Mother Machine)于將細菌許多單個母細胞(Mother Cell)保持在固定位置持續(xù)生長，具體設計如圖 1 所示。其中，圖 1(a)中單細胞生長通道總數(shù) 4 000，寬度為 0.8～2.6 μm (以 0.2 μm 的梯度增加)，高度為 1.2 μm，長度為 25 μm；培養(yǎng)基通道寬度為100 μm，高度為 100 μm，箭頭表示其中液體培養(yǎng)基流動。采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)制作的芯片整體封接在蓋玻片(尺寸 24 mm×50 mm)上，具體內部結構處于 PDMS 與蓋玻片之間：細菌細胞單層生長于較窄、較低的眾多生長通道內，這些單細胞生長通道一端為封閉端，另一端開口與更寬、更高的培養(yǎng)基通道相接，培養(yǎng)基通道兩側開頭通過持續(xù)不斷的液體培養(yǎng)基流動，以及營養(yǎng)物質的擴散作用，為單細胞生長通道內的細胞提供源源不斷的營養(yǎng)成分。在營養(yǎng)充分的條件下，通道內的細菌細胞隨著時間推移逐漸沿著生長通道分裂生長為一條線，多余細胞通過分裂生長自然伸出生長通道，被培養(yǎng)基通道內的高速液體流動沖走。此時，處于生長通道封閉段的母細胞在微流控芯片內的相對位置不變，其營養(yǎng)條件也是穩(wěn)定的，因而整個微流控芯片設計可被看作一種單細胞水平的微量培養(yǎng)恒化器。

                                                                                                                        (a) 示意圖                                                                                                                   (b) 實物圖

圖 1 母細胞芯片微流控芯片圖

2.2.2 硅片模板

 (1)單細胞生長通道的制作

 a. 準備 76.2 mm 的硅片，用低強度等離子處理 30 min。

 b. 從冰箱中取出 SU-8 2002 光刻膠和 SU-8 2000.5 光刻膠，待光刻膠溫度與室溫一致時，按V(SU-8 2002)∶V(SU-8 2000.5)＝8∶2(體積比)將兩種膠在離心管中混勻。

 c. 設定勻膠機程序：預甩 600 r/min，9 s；勻膠 4 000 r/min，30 s。

 d. 將表面潔凈的硅片置于勻膠機吸盤上，在硅片上添加室溫混合膠 2 mL，運行程序。

 e. 將硅片置于平整的熱板上 95 ℃ 烘 2 min。

 f. 在曝光機的吸盤周圍套入橡膠圈，將第一層鉻板掩膜清潔干凈后放在臺架上(鍍鉻面向下)，并開啟真空，將一塊較大的錫箔紙蓋在掩膜上。

 g. 將硅片放在吸盤上，待冷卻后推入(記錄此時硅片的位置，確保在后續(xù)可以對準結構)。

 h. 上升吸盤，用錫箔紙遮蓋，執(zhí)行真空曝光，觀察真空表讀數(shù)——如果漏氣，則復位吸盤后再次上升，確保橡膠圈與掩膜貼合良好不漏氣。

 i. 曝光量為 70 mJ/cm2，需要根據(jù)曝光機的功率調整曝光時間。其中，預設曝光時間應長于真實曝光時間(如需曝光 4 s，則設置 30 s 曝光時間)。啟動曝光時先用錫箔紙遮擋，當剩余時間等于需曝光時間時，快速撤下錫箔紙，結束曝光。

 j. 曝光后于 95 ℃ 烘 1 min，取下硅片，冷卻。

 k. 用丙二醇甲醚醋酸酯(PM)顯影液顯影；隨后用異丙醇沖洗殘留顯影液，接著用氮氣吹干表面，于體視顯微鏡下觀察顯影效果。

 l. 若顯影后結構清晰，則用烘箱 180 ℃ 堅膜1 h，否則重復上一步。

 m. 冷卻后取出，用臺階儀測量子通道高度并記錄。

(2)培養(yǎng)基通道的制作

 整體實驗流程與上部分單細胞生長通道的制作相同，但需要修改一些具體的實驗參數(shù)：使用SU-8 3025 光刻膠，離心 3 000 r/min，前烘30 min，需要進行校準使其與第一層對齊，曝光量為 150 mJ/cm2，后烘 5 min。

2.2.3 PDMS 芯片制作

 (1)固定硅片模板

 a. 將硅片模板用透明膠貼在玻璃板中間(勿貼到結構)，同時在玻璃板四周豎著貼上錫箔膠帶密封，防止倒入 PDMS 單體后在熱固化時泄漏；

 b. 將 PDMS 單體和引發(fā)劑以 10∶1 的質量比混合，攪拌(5 min)均勻，然后抽真空 15 min，再用洗耳球吹除表面剩余氣泡；

 c. 將上一步無氣泡 PDMS 與引發(fā)劑的混合液體，適量倒入第(a)步制作好的貼有硅片模板的玻璃板容器內，放入烘箱內的水平臺上，80 ℃、烘 30 min 以上。

也可以直接用無塵膠帶將模板貼到玻璃板容器中間后，直接倒入 PDMS 和引發(fā)劑進行 PDMS 芯片固化。

 (2)PDMS 芯片固化

 a. 將 PDMS 單體和引發(fā)劑以 10∶1 的質量比混合，攪拌(5 min)均勻后抽真空(10 min)，最后用洗耳球吹除表面剩余氣泡；

 b. 根據(jù)硅片模板表面積及所需微流控芯片厚度計算 PDMS 和引發(fā)劑混合液體用量(這里芯片厚度約為 5 mm，PDMS 和引發(fā)劑混合液體需22 g 左右)，倒在硅片模板上，整體放入烘箱，80 ℃ 烘 1 h 以上。

(3)PDMS 芯片切割

使用手術刀將固化好的芯片從硅片模板上切下，注意不要太靠近芯片結構，刀落到硅片上，切到底可見空氣進入的痕跡，然后將芯片放在LED 燈上進一步切割。

(4)PDMS 芯片打孔

將 PDMS 芯片放在 LED 燈上操作，選擇合適孔徑(這里為 0.8 μm)的打孔器從結構面向下打，拔出時要小心緩慢，可雙向旋轉拔出，注意不要裂口，然后用氮氣氣流清理打好的孔(注意打孔器的針頭最好頻繁更換，以避免打孔時產(chǎn)生過多的 PDMS 碎屑對單細胞培養(yǎng)時產(chǎn)生堵塞通道，可在正式打孔前測試一下)。

(5)PDMS 芯片與蓋玻片封接

 a. 先用異丙醇清洗蓋玻片，然后氮氣吹除異丙醇液體；

 b. 用無塵膠帶粘去 PDMS 芯片結構面灰塵及碎屑；

 c. 將蓋玻片和 PDMS 芯片結構面向上放置，一起進行等離子清洗——HI 檔(18 W，氣壓266 Pa，氣流 25 mL/h)，2 min(等離子處理時間可調整，一般不要超過 2 min)；

 d. PDMS 芯片依靠重力貼在玻璃板上(多塊芯片考慮排布以合理利用空間)，若貼合過程迅速則表明等離子處理后 PDMS 芯片和蓋玻片表面性質良好；

 e. 貼合后的芯片放入烘箱 80 ℃ 烘 10 min。

 (6)通道修飾及鏡檢

 a. 將已過濾除菌的 1% F-127 水溶液，通過培養(yǎng)基通道入口緩慢注入芯片(戴護目鏡)，修飾至少 30 min；

 b. 10 倍鏡或 20 倍鏡下檢查芯片通道(是否完好)、打孔及封接情況，無誤后放入?yún)捬豕ぷ髡尽?/span>

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