剪切誘導結晶的定量

雖然上述展示了一種微流控平臺，能夠誘導重組MaSp2快速自組裝成分層結構的纖維，以響應連續(xù)的生理觸發(fā)，但另一個主要問題是這樣的系統(tǒng)是否能夠成功誘導β片結構的形成，這是蜘蛛絲拉伸強度的主要來源。

通過共聚焦拉曼光譜監(jiān)測微流控芯片內蛋白質構象的變化，分辨率為0.8 cm?1（圖3a）。從天然蜘蛛拉索絲纖維中收集的光譜用作參考，在1670（酰胺I，C = O拉伸），1615（Tyr），1452（CH3不對稱彎曲，CH2彎曲），1242（酰胺III，N-H彎曲+ C-N拉伸），1175（Tyr）和~1078/1094 cm?1（骨骼Cα-Cβ拉伸）的預期位置產生了明確的峰。在這些峰中，酰胺I、酰胺III和骨架C-C峰對二級結構的變化很敏感，特別是關于β片構象31。通常，可以對酰胺I或III區(qū)域內的峰進行反卷積以計算二級結構組成32。然而，PDMS和蓋玻片分別在1266和1098 cm?1處產生重疊信號，因此我們專注于酰胺I區(qū)域周圍的區(qū)域，以定量分析二級結構含量。初步測試證實，在微流體環(huán)境之外，暴露于仿生化學觸發(fā)物的三域MaSp2，但在沒有機械變形的情況下，未能產生β片構象（圖3b）;而作為陽性對照，經90%甲醇處理的MaSp2縮合物在1668 cm?1處產生了β片構象的特征酰胺I峰。

使用 N-R6-C、N-R12-C 和 N-R12-C（xA） 進行的拉曼測量揭示了在微流控裝置中自組裝過程中蛋白質二級結構的演變（圖 3c），補充了觀察到的形態(tài)變化。在LLPS液滴狀態(tài)（A部分）期間，所有樣品的光譜都與大部分無序/a螺旋構象一致，峰值為~1654 cm?1。值得注意的是，對于N-R12-C，觀察到在~1664 cm?1處逐漸出現(xiàn)一個額外的峰，這歸因于β片結構。從1580到1720 cm?1的酰胺I區(qū)域的反卷積提供了二級結構貢獻的估計。如附表2所示，N-R12-C的估計β片含量從A部分的12.5%增加到B部分的22.5%，最后增加到C部分的最高29.2%。相比之下，對于N-R6-C，串聯(lián)重復次數只有一半，盡管組裝了形態(tài)相似的纖維，但未檢測到明顯的β片峰;我們假設觸發(fā) 6 重復結構中結構變化的壓力閾值高于 12 重復結構，施加的壓力為 -90 kPa（我們系統(tǒng)的上限）顯然不足以驅動 N-R6-C 中豐富的β片形成。同樣，對于突變體N-R12-C（xA），沒有觀察到二級結構轉變，這與聚丙氨酸形成蠶絲纖維β片晶體成分的基礎一致。

值得注意的是，雖然N-R12-C在A段中受到的剪切力略高于B段（圖4c，e），但在后一段中檢測到β片含量的顯著增加。因此可以推斷，A部分中離子交換引發(fā)的剪切和LLPS的簡單組合不足以誘導構象轉變。因此，很明顯，B部分中酸化引起的纖維化，以及相關的粘度增加，也是我們微流控系統(tǒng)中β片形成協(xié)同過程的必要先決條件。

為了檢驗觸發(fā)β片涌現(xiàn)的閾值假設，在不同大小的負壓下進行N-R12-C的微流控組裝（圖.3d）。在較低水平（-40至-50 kPa）下，沒有獲得纖維，而是蛋白質形成聚集體。相反，在-60至-90 kPa之間形成了分層纖維，負壓的大小與β片構象的比例呈正相關（圖3e）。有趣的是，?60 kPa被證實是蠶絲纖維形成的閾值壓力，其平均β片含量為17.8%。隨著壓力的增加，β片含量逐漸增加21.5%（?70 kPa時）、23.7%（?80 kPa時）和28.9%（?90 kPa時）。假設如果壓力超過受我們實驗系統(tǒng)限制的?90 kPa，則可以在蠶絲纖維中誘導更多的β片。這一結果表明，通過施加壓力的細微變化來調整纖維結構的潛力。

在離開蜘蛛的噴絲頭后，通常會對拉絲進行進一步拉伸，以實現(xiàn)更高程度的結晶和取向。這種自然行為代表了與強制卷蠶絲和后拉絲紡纖維相同的原理。因此，我們研究了通過我們的微流控裝置與手動拉絲纖維可以實現(xiàn)的β片形成的相對水平（圖3f）。雖然使用手動拉伸方法無法誘導精確的 pH 梯度和剪切，但手動拉伸產生的伸長力通常被認為是強大的，并且是充分誘導β片的原因。雖然微流控系統(tǒng)可以驅動重組絲纖維的免提仿生組裝，但與手動拉制相分離MaSp2（即使在較短的N-R6-C結構中產生β片）產生的纖維相比，所得纖維顯示出較低的β片含量（補充表2）。這可能反映了纖維在空氣中外部拉伸所產生的更大程度的機械變形，以及脫水效應。為了支持拉曼結果，廣角X射線散射（WAXS）結果表明，通過不同紡絲方法形成的MaSp2纖維中β片納米晶體的含量具有相同的趨勢（補充圖6）。峰（020）歸一化后，峰（010）處的強度表明，手工拉絲纖維的相對結晶度與重復域內聚丙氨酸塊數呈正相關。在沒有聚丙氨酸塊的情況下，充分手工拉絲制備的N-R12-C（xA）纖維的結晶度仍低于微流控紡絲制備的N-R12-C纖維。無論如何，這些結果表明，通過將水紡方法與機械后處理步驟相結合，可以進一步微調仿生絲的性能。

為了闡明MaSp2光纖組裝機理，我們對器件運行過程中組件的分布和物理力的相互作用進行了數值模擬。在建模之前，進行了流變學實驗，以探測濃度為5至150 mg/ml的N-R12-C溶液的粘彈性（圖4a，b）。與其他重組 （NT2RepCT） 和天然螺旋體蛋白 36,37 的報告結果一致，N-R12-C 溶液表現(xiàn)出典型的剪切稀化行為，隨著剪切速率的增加，粘度降低。在25 °C下剪切速率為1 s?1時，天然螺桿菌的剪切粘度約為103 Pa s，遠高于N-R12-C（均低于10 Pa s）和NT2RepCT（均低于1 Pa s）。與重組螺旋體相比，天然螺旋體蛋白的濃度和分子量要高得多，因此可以解釋這種顯著差異。為了直接比較相同濃度（如100 mg/ml）下重組螺旋體之間的剪切粘度，N-R12-C表現(xiàn)出明顯更高的剪切粘度（~2 Pa s），比NT2RepCT報告的剪切粘度（0.05–0.1 Pa s）高20倍以上，這可能歸因于重復單元的數量不同（12次重復與2次重復）。在這項工作中，發(fā)現(xiàn)重復區(qū)域中的丙氨酸殘基對螺旋體的粘度有顯著貢獻，與N-R12-C相比，N-R12-C（xA）的粘度較低。

剪切稀化機理尚不完全清楚，基于膠體和聚合物體系提出了兩種理論38,39。在膠體系統(tǒng)中，流動過程中的相分離導致了剪切變薄行為，這種現(xiàn)象歸因于聚合物系統(tǒng)中分子鏈的解開。由于N-R12-C是一種生物聚合物，可以剪切以誘導相分離，因此其剪切稀化行為非常符合這兩種理論。使用Carreau模型擬合不同濃度下的粘度-剪切速率曲線，建立了非牛頓三維模型。通過這種方式，模擬了各種離子（檸檬酸鹽、磷酸鹽、氯離子和鈉離子）、蛋白質濃度、剪切和伸長率/應力沿通道的分布。

在器件內部產生的物理力方面，正如設計所預期的那樣，器件內的伸長流效應被最小化，A和C部分的非收斂通道中的值可以忽略不計（補充圖9）。由于交叉幾何形狀，在A和B截面之間的閾值區(qū)域，材料蛋白質可能會施加一定的伸長應力，但在確認局部剪切應力比伸長應力高9倍以上后，我們認為其影響微不足道。

另一方面，剪切效應在整個通道的纖維組裝過程中發(fā)揮了主導作用，從A段到C段的剪切富集區(qū)域（圖4c）和MaSp2（圖2a，b）的共定位一致，與比壓相對應，我們的模型有效地預測了通道內剪切應力/速率的分布和值（圖4d，e和補充圖10）。如上所述，?60 kPa是微流控內部蠶絲纖維組裝所需的臨界壓力，相當于72 Pa和52282 s?1的閾值剪切應力和速率。值得注意的是，MaSp2組裝所需的估計剪切速率（52282 s?1）比天然螺旋體（1500–3500 s?1）40,41的報道高一個數量級。這一結果可以通過重組和天然螺旋蛋白在濃度、粘度和分子量（重復域長度）方面的差異以及計算建模中定義的旋轉和邊界條件來解釋。僅觀察到具有至少 12 個聚丙氨酸塊的三域 MaSp2 纖維出現(xiàn)剪切誘導的 β 片，并且 N-R12-C 纖維內的 β 片含量估計在 18% 至 29% 之間，這是通過將剪切應力從 72 Pa 變化到 111 Pa 來調節(jié)的（圖 4f）。顯然，通過使用剪切流的分子動力學模擬，具有至少 6 個聚丙氨酸塊且沒有 CTD 和 NTD 的 MaSp1 纖維能夠在高達 300–700 MPa42 的剪切應力下形成富含β片的結構。

LLPS是蠶絲組裝過程中的第一步，對于負責分層組織的納米纖維化至關重要（補充討論）。與我們之前的研究一致12，必須需要完整的結構域才能實現(xiàn) LLPS 和納米纖顫以形成 MaSp2 纖維。迄今為止，驅動LLPS的潛在機制在很大程度上仍然未知。正如最近報道的那樣，Tyr和Arg殘基的功能類似于分子“粘物”，通過LLPS誘導螺旋體的相分離。在這項工作中，通過觀察 N-R12-C（xA） 對 kosmotropic 陰離子觸發(fā)的自發(fā)反應，Ala 殘基，特別是串聯(lián)形式（即聚丙氨酸塊）被確認為影響 LLPS 的無關因素。同樣，在N-R12-C（xA）纖維中，沒有聚丙氨酸塊，宏觀上無法區(qū)分的分層結構，因此沒有看到納米纖維顫動受到抑制（圖5a）。

在沒有使用成熟的液晶和膠束理論的情況下，LLPS被當作一個范式，以適當地理解我們仿生紡絲系統(tǒng)中的絲自組裝過程（補充討論）。將天然樣觸發(fā)器依次引入微流體通道以產生離子和 pH 梯度，從而將 MaSp2 誘導到含有固體納米纖維的纖維中（圖 5b）。化學和物理觸發(fā)因素都是必需的，并且協(xié)同作用于纖維的形成，但后者在二級結構的轉變中起著主導作用。應用微流控系統(tǒng)來控制剪切是靈活的，這在這項工作中得到了強調，以研究其對結晶的影響。通過調節(jié)剪切應力，有望制造出具有微妙調諧的β片結構的人造絲纖維。

綜上所述，通過使用微流控裝置，我們報道了一種仿生策略，用于探測從LLPS到納米纖維化再到分層組織纖維的天然組裝過程中的β片發(fā)展。本工作為仿生紡紗在域結構、微流控制備、剪切閾值和層次重構方面的合理設計提供了依據。未來的工作將集中在研究仿生紡紗條件下組合的 MaSp1 和 MaSp2 螺旋體的絲組裝。將全面評估CTD和/或NTD形成的異二聚化，以更好地了解天然紡絲過程中螺旋體之間的相互作用。此外，基因序列中的特定氨基酸殘基將被編輯/取代，以探索LLPS的潛在機制。

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