最近，外泌體因其在疾病發(fā)展中發(fā)揮的重要作用而被公認(rèn)為重要的疾病生物標(biāo)志物。然而，從復(fù)雜體液中高效分離和富集外泌體繼續(xù)阻礙著外泌體臨床應(yīng)用的研究和應(yīng)用。在這項(xiàng)工作中，我們開(kāi)發(fā)了一種基于雙切向流過(guò)濾的微流控裝置，用于從細(xì)胞上清液和人血清中分離外泌體。微流控裝置包含兩個(gè)模塊。每個(gè)模塊包括兩個(gè)聚甲基丙烯酸甲酯 （PMMA） 板，具有對(duì)稱的蛇形通道和一個(gè)孔徑為 200 nm 或 30 nm 的納米多孔膜，用于分離較大的囊泡、外泌體和游離生物分子。對(duì)稱蛇形通道中的雙切向流過(guò)濾設(shè)計(jì)大大增加了濾液與納米多孔膜的接觸面積，從而提高了分離效率，防止了膜的堵塞。與超速離心（UC）標(biāo)準(zhǔn)分離方法相比，基于微流控芯片的外泌體分離（Chip）具有儀器成本更低、耗材成本更低、時(shí)間更短（<120 min）、純度更高（82.8%）、回收率顯著提高（77.8%）等優(yōu)點(diǎn)。此外，由于無(wú)標(biāo)記分離，微流控裝置收集的外泌體可直接用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析等下游分析。該芯片從臨床不同疾病患者血清中分離出的外泌體的蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果顯示，與UC分離的外泌體相比，該芯片具有更豐富的疾病相關(guān)信息，證明了該芯片在未來(lái)臨床上具有良好的實(shí)用性。

細(xì)胞外囊泡是具有磷脂雙層結(jié)構(gòu)的囊泡，幾乎可以由所有類型的細(xì)胞分泌，根據(jù)其大小和形成途徑，大致可分為外泌體、微囊泡和凋亡小體三類。在這些囊泡中，外泌體具有狹窄的尺寸分布，直徑范圍為 40 至 200 nm。外泌體廣泛存在于生物體液中，參與各種生理和病理過(guò)程，在細(xì)胞間通訊過(guò)程中發(fā)揮重要作用。腫瘤來(lái)源的外泌體是腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的有效介質(zhì)，攜帶有關(guān)腫瘤細(xì)胞的特定分子信息，如蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)體和細(xì)胞內(nèi)代謝物。此外，越來(lái)越多的研究采用外泌體作為載藥載體來(lái)治療疾病，因?yàn)樗鼈兙哂辛己玫纳锵嗳菪院洼^高的治療效率。因此，外泌體在臨床診斷和疾病治療中都是很有前途的工具。解決一些基本的技術(shù)問(wèn)題，如外泌體的分離、富集、分子表征和工程化，是這些應(yīng)用中的重要任務(wù)。

然而，生物體液的組成通常非常復(fù)雜。例如，多種蛋白質(zhì)、核酸、囊泡和代謝物共存于人血清中。因此，從人血清中準(zhǔn)確提取外泌體是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)?；谕饷隗w的密度、形狀、大小和特異性表面蛋白表達(dá)，已經(jīng)發(fā)展出許多分離方法，如基于密度的分離技術(shù)、基于大小的分離技術(shù)、基于免疫親和捕獲的技術(shù)、外泌體沉淀和基于微流控的分離技術(shù)。其中，無(wú)標(biāo)記分離方法是近年來(lái)外泌體分離的趨勢(shì)，避免了標(biāo)記劑的引入，減少了潛在的污染物，對(duì)外泌體的下游分子表征或工程化具有重要意義。到目前為止，超速離心一直是無(wú)標(biāo)記外泌體分離的金標(biāo)準(zhǔn)。然而，由于其回收率低、純度低、操作繁瑣且需要昂貴的設(shè)備，難以滿足臨床需求。尺寸排阻色譜（SEC）是另一種以高產(chǎn)量和高純度快速分離外泌體的寶貴技術(shù)。然而，應(yīng)使用大量的緩沖溶液從分離柱中洗脫外泌體，這導(dǎo)致收集的外泌體濃度相對(duì)較低。如果需要下游分析，可能需要在UC的幫助下富集外泌體。近年來(lái)，微流控技術(shù)顯著推進(jìn)了納米級(jí)顆粒的無(wú)標(biāo)記分離。到目前為止，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了許多用于分離外泌體的微流控平臺(tái)，例如基于粘彈性、聲學(xué)、慣性、電和離心力的微流控平臺(tái)。使用微流控技術(shù)進(jìn)行外泌體分離仍存在一些緊迫的問(wèn)題，如器件制造的復(fù)雜性、成本仍然很高、需要特殊設(shè)備等。最近，基于膜過(guò)濾的微流控裝置被開(kāi)發(fā)出來(lái)，通過(guò)納米多孔膜的尺寸篩分，將外泌體與體液中的其他成分直接分離。這些設(shè)備相對(duì)容易制造，制造和運(yùn)營(yíng)成本低。更重要的是，外泌體分離效率相對(duì)較高，產(chǎn)率較高，操作時(shí)間短，具有巨大的臨床應(yīng)用潛力。然而，大多數(shù)基于膜過(guò)濾的微流控裝置在外泌體分離中使用垂直過(guò)濾，導(dǎo)致系統(tǒng)中壓力過(guò)大并容易堵塞。最近，Qiao等人設(shè)計(jì)了一種基于切向流過(guò)濾的微流控芯片，用于從人血漿中分離外泌體[26]。切向流設(shè)計(jì)避免了垂直過(guò)濾壓力大、易堵塞等問(wèn)題，蛇形通道設(shè)計(jì)允許液體與濾膜接觸面積更大。然而，在注入微流控裝置進(jìn)行外泌體分離之前，仍應(yīng)使用高速離心對(duì)血漿樣品進(jìn)行預(yù)處理。該裝置只能用于從蛋白質(zhì)污染物中分離外泌體，這嚴(yán)重限制了該裝置的廣泛應(yīng)用。

腫瘤來(lái)源的外泌體攜帶來(lái)自母體細(xì)胞的豐富信息，包括四跨膜蛋白、細(xì)胞信號(hào)分子、致癌蛋白、伴侶蛋白、細(xì)胞骨架、遺傳物質(zhì)、蛋白酶和抑癌基因。對(duì)于癌癥患者來(lái)說(shuō)，腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體將攜帶豐富的疾病相關(guān)信息。腫瘤細(xì)胞與腫瘤分泌的外泌體之間的相關(guān)性將成為癌癥診斷和后續(xù)治療的重要基石。蛋白質(zhì)是疾病發(fā)展中的主要功能分子。因此，更好地了解外泌體中的蛋白質(zhì)組成對(duì)于癌癥的評(píng)估至關(guān)重要。蛋白質(zhì)組學(xué)是揭示蛋白質(zhì)組成、結(jié)構(gòu)和活性的有用方法。使用蛋白質(zhì)組學(xué)分析外泌體蛋白有望大大加深我們對(duì)外泌體和疾病的理解。

在此，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種基于雙切向流過(guò)濾的微流控裝置，用于外泌體分離和富集。使用孔徑為 200 nm 和 30 nm 的多孔膜分選出 30 至 200 nm 之間的囊泡，可以分離和純化來(lái)自常規(guī)外泌體溶液（細(xì)胞培養(yǎng)上清液和人血清）的外泌體。比較了本方法與UC方法的回收率、純度、設(shè)備和耗材成本以及操作時(shí)間。此外，通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)兩種方法分離的肝臟相關(guān)疾病患者血清中的外泌體進(jìn)行分析和比較，實(shí)現(xiàn)了對(duì)不同疾病類型的區(qū)分和可能的治療靶點(diǎn)的篩選。

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