1、什么是海藻酸鈉微球

海藻酸鹽(海藻酸鈉)又稱(chēng)褐藻酸鈉，是一類(lèi)從褐藻、海帶、馬尾藻、巨藻等可食用的海洋藻類(lèi)植物的細(xì)胞壁中提取出的天然線(xiàn)性多糖，由1-4糖苷鍵鍵合的β-D-甘露糖醛酸(M單元)和α-L-古洛糖醛酸(G單元)殘基組成。海藻酸鈉作為微球載體材料已經(jīng)多有報(bào)道，如劉善奎等利用乳化-交聯(lián)法制備的DNA疫苗海藻酸鈉微球，其粒徑在12.03±6.9μm，載藥量為5%，包封率為56%，藥物釋放維持10天。以下圖1是海藻酸鈉結(jié)構(gòu)式。

圖1 海藻酸鈉的結(jié)構(gòu)式

海藻酸鈉微球的研究意義：在藥劑學(xué)中，微球(microspheres)是指藥物被溶解、分散或被吸附在藥物載體材料如高分子聚合物中而形成的骨架型(matrixtype)球形微粒。微球的主要作用包括：靶向性作用、緩釋與控釋作用、栓塞作用、降低藥物刺激性和提高藥物穩(wěn)定性作用。微球栓塞劑的性能也隨著介入治療在臨床治療中地位的提升而逐漸引起科研人員的重視。介入栓塞術(shù)是借助于導(dǎo)管將栓塞劑選擇性地導(dǎo)入到癌癥組織動(dòng)脈血管和微血管，以達(dá)到阻斷腫瘤組織營(yíng)養(yǎng)供給，抑制其生長(zhǎng)的目的。另外，對(duì)于無(wú)法手術(shù)治療的肝癌患者，介入栓塞術(shù)可控制病變部位惡化，減少患者疼痛，起到提高生存質(zhì)量的作用。栓塞劑對(duì)栓塞術(shù)的成功起著至關(guān)重要的作用。綜合來(lái)說(shuō)，一種理想的栓塞材料應(yīng)該具備無(wú)毒、無(wú)抗原性、生物組織相容性好、可根據(jù)病灶要求控制栓塞時(shí)間等特點(diǎn)，而且制劑易制備，易導(dǎo)入，易滅菌，粒徑的均一性可控性，成本低廉也是選擇栓塞材料必需考慮的重要因素。天然多糖高分子微球由于具有良好的生物相容性和生物可降解性而備受介入治療領(lǐng)域的關(guān)注，在臨床應(yīng)用方面具有良好的前景。海藻酸鈉是一種常用的天然多糖高分子材料，由L-古洛糖醛酸和D-甘露糖醛酸兩種糖單元構(gòu)成。海藻酸鈉主要由海藻類(lèi)植物提取而來(lái)，具有易得、易改性、生物相容性良好等優(yōu)點(diǎn)。海藻酸鈉可與Ca2+，Zn2+等離子交聯(lián)反應(yīng)形成“蛋盒”結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生大分子鏈間交聯(lián)固化，可根據(jù)臨床需要加工制備成各種粒徑大小的固態(tài)微球。海藻酸鹽微球具有良好的力學(xué)穩(wěn)定性和生物相容性，栓塞血管后無(wú)免疫反應(yīng)，且其可降解性使得一段時(shí)間后以分子鏈脫解的形式降解，終產(chǎn)物為能為人體代謝的多糖。目前國(guó)內(nèi)已有海藻酸鈉微球血管栓塞劑上市，但產(chǎn)品存在粒徑分布范圍廣、尺寸不可控、只能通過(guò)粒徑控制降解周期等問(wèn)題，粒徑不均一、不可控的微球在臨床使用過(guò)程中容易造成除靶血管外的其他組織或器官栓塞，尤其是粒徑微小(20μm以下)的微球容易通過(guò)血液流向肺部，造成危及生命的肺部栓塞;只通過(guò)粒徑控制降解周期的微球，不能很好地滿(mǎn)足病灶點(diǎn)的栓塞要求，容易出現(xiàn)粒徑合適但是栓塞時(shí)間不充分的情況，不僅影響治療效果，而且需多次栓塞給病患增加麻煩。目前研究中制備載藥海藻酸鈉微球的方法，大多采用靜電生成法、相分離法、復(fù)相乳液法或攪拌乳化法形成液滴，然后與鈣離子交聯(lián)形成微球。以上方法制備的微球粒徑分布較廣，不易控制，且不易實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。目前有望解決上述問(wèn)題的是利用微流控芯片技術(shù)制備海藻酸鈉微球，該方法制備的海藻酸鈉微球粒徑均一、尺寸可控，在同一粒徑范圍內(nèi)可控制其降解速度。

2、利用微流控芯片技術(shù)制備海藻酸鈉微球的原理及方法

使用微流控芯片技術(shù)制備海藻酸鈉微球，常采用流道聚焦法來(lái)生成油包水的微液滴。如下圖所示，在流動(dòng)聚焦法中，三條流路聚焦一個(gè)管道中，分散相和流動(dòng)相匯合于十字交叉管處，上下對(duì)稱(chēng)的流動(dòng)相同時(shí)擠壓分散相使其斷裂，從而形成液滴。通常分散相為海藻酸鈉水溶液，流動(dòng)相為油相，兩相流經(jīng)聚焦型結(jié)構(gòu)的十字處，擠壓形成海藻酸鈉液滴。

圖2 流道聚焦法制備海藻酸鈉微球

3、制備海藻酸鈉微球所需的試劑

(1) 微滴生成油 (含2% 表面活性劑的HFE-7500 (wt%))

(2) EDTA (0.5 M, pH 7.4 Macklin, E885215-1L)

(3) NaOH (Macklin, S817971-500 G)

(4) CaCl2 (無(wú)水, 99.99%, Macklin, C805228-100 G)

(5) 海藻酸鈉 (黏度 200 mpa.s)

(6) 乙酸 (99.8%, Macklin, A801296-500 ML)

(7) 1H,1H,2H,2H-全氟己-1-醇 (PFO, 98%, Macklin, H817022-25 G)

(8) HFE-7500 (3M NovecTM)

(9) n-Hexane (正己烷, HPLC, H810749-1L)

(10) SpanTM 80 (Aladdin, S110839-250 ML)

(11) 去離子水

4、制備海藻酸鈉微球所需的實(shí)驗(yàn)儀器

(1) 兩通道微流控芯片進(jìn)樣用恒壓泵也稱(chēng)壓力控制器

(2) 100 μm剪切口疏水的微流控玻璃芯片(液滴)

(3) 配套微流控玻璃芯片夾具

(4) PTFE 管(0.6/1.6 mm)若干

(5) 配有高速相機(jī)的普通光學(xué)顯微鏡及配套軟件

(6) 兩個(gè)流量傳感器 (規(guī)格: 80 μL/min)

(7) 兩個(gè)儲(chǔ)液池 (規(guī)格: 15 mL和50 mL)

(8) 水平旋轉(zhuǎn)儀

(9) 萬(wàn)分位電子分析天平

(10) 梅特勒pH計(jì)

(11) 高速離心機(jī)

(12) 100 μm細(xì)胞濾網(wǎng)

(13) 20 mL透明玻璃瓶

(14) 玻璃培養(yǎng)皿 (直徑100 mm)

圖3 采用微流控液滴芯片制備的海藻酸鈉微球粒徑分布

5、制備海藻酸鈉微球的溶液配制方法

（1）4 M NaOH

取8.0 g NaOH置于50 mL Falcon離心管中，用去離子水溶解并定容至50 mL。

（2）5 M CaCl2

取11.1 g CaCl2置于50 mL Falcon離心管中，用去離子水溶解并定容至20 mL。

（3）2 %海藻酸鈉水溶液 (wt%)

取0.2 g 海藻酸鈉置于15 mL Falcon離心管中，加入去離子水至10 g。

注意：溶解海藻酸鈉時(shí)用時(shí)較久，要不斷的超聲并渦旋振蕩，最后靜置將個(gè)別碎沫慢慢溶解 (以上僅為個(gè)人建議，不同廠家溶解效果也不一樣，能否做出也未可知)。

（4）400 mM Ca-EDTA

取400 μL 的5 M CaCl2 ，4 mL EDTA (0.5M, pH7.4)加入20 mL 透明玻璃瓶中并振蕩均勻，然后用 4 M NaOH調(diào)整pH至7.2，最后加入去離子純凈水定容至5 mL。

注意: 調(diào)pH加NaOH溶液時(shí)，需少量多次。初始pH為3.65左右，待加至pH為5.6以上時(shí)需盡可能減少NaOH溶液加入的量，適當(dāng)可用移液槍取1 μL 或更少的量加入。

（5）1% 海藻酸鈉 (wt%)- 200 mM Ca-EDTA

將2 % 海藻酸鈉水溶液和400 mM Ca-EDTA等體積混合，使用0.22 μm PTFE微孔膜過(guò)濾。

（6）20% PFO/HFE-7500 (v/v)

取5 mL PFO 置于50 mL Falcon離心管中，用HFE-7500定容至25 mL，振蕩均勻。

（7）1% Span 80 in Hexane (v/v)

取0.3 mL Span 80加入Hexane定容至30 mL，振蕩均勻.

（8）2 % 乙酸/微滴生成油 (v/v)

取200 μL 的乙酸加入 15 mL Falcon離心管中，用微滴生成油定容至10 mL，振蕩均勻。

6、利用微流控芯片技術(shù)制備海藻酸鈉微球的實(shí)驗(yàn)操作

(1) 連接設(shè)備、儲(chǔ)液池和兩路流量傳感器；

(2) 將微滴生成油和1% 海藻酸鈉-200 mM Ca-EDTA水相分別加入至50和15 mL的儲(chǔ)液池中;

(3) 用軟件控制分別給兩個(gè)通道一定的壓力以排出管路中的空氣，待有液體流出時(shí)再分別關(guān)掉壓力;

(4) 分別將油相和水相管插入經(jīng)疏水處理的玻璃芯片對(duì)應(yīng)的油相和水相入口（玻璃芯片安裝在夾具上，直接將導(dǎo)管插入夾具即可），然后取一段30 cm PTFE管插入玻璃芯片出口；

(5) 用軟件控制并設(shè)置流速，比如油相流速為70 μL /min，水相流速為7 μL /min;

(6) 待微球穩(wěn)定生成后，將裝有10 mL 2%乙酸微的滴生成油的玻璃培養(yǎng)皿放置于管路出口開(kāi)始收集，且收集過(guò)程中需要用水平旋轉(zhuǎn)儀振蕩;

(7) 注意：水平旋轉(zhuǎn)儀振蕩速度50 rpm/min以下，且保證收集的微球一直能滴入培養(yǎng)皿中；收集時(shí)可以用保鮮膜蓋在收集管上盡量減少乙酸的揮發(fā)

(8) 收集完畢后可以適當(dāng)補(bǔ)充乙酸以保證其濃度基本維持不變，然后振蕩固化12 h；

(9) 待固化完全后，5000 rpm, 3min離心處理；

(10) 用移液槍取出底部油相，然后按2:1 (vPFO:v微球)加入20% PFO的HFE-7500，5000 rpm, 3min離心處理至少兩次;

(11) 用移液槍取出底部溶液，然后按2:1 (vn-Hexane:v微球)加入1% Span 80的n-Hexane，5000 rpm, 3min離心處理至少兩次；

(12) 用移液槍取出上部溶液，加入一定體積PBS 5000 rpm, 5min離心處理，最終分散于PBS中;

(13) 固化后的微球可以用100 μm細(xì)胞過(guò)濾器過(guò)濾。

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