隨著核醫(yī)學(xué)、核電等核技術(shù)的廣泛應(yīng)用，意外核事故等突發(fā)公共事件發(fā)生的可能性顯著增加。機(jī)體受到高劑量電離輻射（> 1 Gy）后可導(dǎo)致急性放射綜合征（ARS）。ARS常涉及多種組織器官系統(tǒng)的損傷，輕則出現(xiàn)惡心、嘔吐等癥狀，重則導(dǎo)致死亡。根據(jù)不同的臨床表現(xiàn)和結(jié)局，ARS一般分為造血系統(tǒng)型（2 Gy ~ 6 Gy）、胃腸型（6 Gy ~ 10 Gy）和腦型（> 10 Gy）等亞綜合征，與人體吸收的輻射劑量緊密相關(guān)。因此，輻射暴露人員受照劑量的準(zhǔn)確測(cè)定對(duì)于放射事故后潛在暴露個(gè)體的醫(yī)學(xué)處置至關(guān)重要。在過去幾十年里，細(xì)胞微核和雙著絲粒測(cè)定等生物劑量測(cè)定方法已被用于輻射暴露的真實(shí)案例中。然而，這些檢測(cè)方法仍然存在一定的局限性，特別是檢測(cè)前需要最短48小時(shí)的細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間，因而難以實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)便、快速和高通量等要求。因此，亟需發(fā)現(xiàn)新的更為高效的輻射劑量生物標(biāo)志物并開發(fā)高通量檢測(cè)方法，以應(yīng)對(duì)突發(fā)放射性事件中潛在受照個(gè)體的大規(guī)模篩查、診斷和醫(yī)學(xué)分類。

近日，軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院研究員周鋼橋/盧一鳴團(tuán)隊(duì)與 北京航空航天大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院常凌乾課題組在 Nature Communications和 Biosensors & Bioelectronics期刊上發(fā)表系列研究工作，發(fā)現(xiàn)了基于RNA的N6-甲基腺苷（m6A）修飾的新型輻射劑量生物標(biāo)志物，并開發(fā)了相應(yīng)的高通量微流控芯片檢測(cè)方法。首先，周鋼橋/盧一鳴團(tuán)隊(duì)在 Nature Communications期刊上發(fā)表了題為“RNA N6-methyladenosine modification-based biomarkers for absorbed ionizing radiation dose estimation ”的研究論文。該研究首次發(fā)現(xiàn)了基于RNA m6A修飾的新型輻射暴露劑量生物標(biāo)志物，并建立了基于該修飾的人體輻射暴露劑量預(yù)測(cè)模型，為意外核事故后輻射暴露人員受照劑量的高通量測(cè)定和醫(yī)學(xué)分類提供了全新方案。

輻照小鼠PBMCs轉(zhuǎn)錄組和表觀轉(zhuǎn)錄組的動(dòng)態(tài)變化。

研究者首先對(duì)小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）中響應(yīng)電離輻射的mRNA分子進(jìn)行了全轉(zhuǎn)錄組篩選，發(fā)現(xiàn)急性電離輻射暴露后RNA m6A水平發(fā)生顯著的變化。而且，與RNA轉(zhuǎn)錄水平相比，RNA m6A修飾水平的改變更加穩(wěn)定和持久，提示其更適合作為暴露后中長(zhǎng)期有效的輻射標(biāo)志物。其中，Ncoa4、Ate1和Fgf22三個(gè)基因的RNA m6A修飾水平在輻射暴露小鼠PBMC中表現(xiàn)出良好的量效關(guān)系，提示它們可以作為輻射暴露的生物標(biāo)志物。特別是，Ncoa4基因的RNA m6A在輻射暴露后長(zhǎng)達(dá)28天仍處于顯著升高狀態(tài)，提示其作為理想輻射標(biāo)志物的優(yōu)良表現(xiàn)。研究者進(jìn)一步排除了其他混雜因素，如炎癥、性別和年齡等對(duì)量效關(guān)系的影響，證明了其對(duì)電離輻射的反應(yīng)特異性。

m6A 修飾的 NCOA4 mRNA 在輻射暴露人類的 PBMC 中的反應(yīng)

快速和高通量生物劑量計(jì)對(duì)于放射事故后的有效醫(yī)療管理至關(guān)重要，在放射事故中，大量個(gè)體可能會(huì)暴露在未知?jiǎng)┝康妮椛湎?。在這里，我們對(duì)輻射響應(yīng)的 mRNA 轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行了全轉(zhuǎn)錄組篩選，其 m6A 修飾水平揭示了急性輻射暴露后的顯著變化。我們發(fā)現(xiàn) Ncoa4、Ate1 和 Fgf22 三個(gè)基因的 RNA m6A 水平顯示出良好的劑量反應(yīng)性，因此可能作為輻射暴露的候選生物標(biāo)志物。特別是NCOR4 mRNA的m6A修飾在跨物種保守性、劑量反應(yīng)性、響應(yīng)特異性和較長(zhǎng)的輻射檢測(cè)持續(xù)時(shí)間方面表現(xiàn)出優(yōu)異的性能。據(jù)我們所知，這是第一項(xiàng)評(píng)估RNA m6A修飾作為候選生物標(biāo)志物在檢測(cè)輻射暴露中的應(yīng)用的研究。

最近，幾項(xiàng)研究揭示了m6A RNA甲基化與多種遺傳毒性和非遺傳毒性應(yīng)激之間的密切關(guān)系。例如，在紫外線的應(yīng)激下，m6A RNA 和 METTL16（一種 m6A 甲基轉(zhuǎn)移酶）被募集到 DNA 損傷位點(diǎn)，并通過促進(jìn)核苷酸切除修復(fù) （NER） 途徑促進(jìn) DNA 修復(fù)。亞砷酸鹽誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激可以增加編碼RNA m6A“寫入者”的兩個(gè)基因WTAP和METTL的表達(dá)，以及整體m6A水平，進(jìn)而調(diào)節(jié)靶RNA響應(yīng)氧化應(yīng)激。作為對(duì)電離輻射的響應(yīng)，METTL3（另一種 m6A 甲基轉(zhuǎn)移酶）和 FTO（一種 m6A 去甲基化酶）已被證明以 RNA m6A 介導(dǎo)的方式有助于抗輻射。此外，新出現(xiàn)的證據(jù)表明 RNA m6A 對(duì)其他類型的應(yīng)激起著關(guān)鍵作用，包括缺氧、治療應(yīng)激、代謝應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng) （ER） 應(yīng)激。因此，這些發(fā)現(xiàn)表明了關(guān)注RNA m6A修飾以篩選響應(yīng)輻照的候選生物標(biāo)志物的機(jī)會(huì)。

事實(shí)上，一些開創(chuàng)性的研究已經(jīng)暗示了RNA m6A修飾作為多種疾病生物標(biāo)志物的潛力。在癌癥方面，基于IGF2BP2、IGF2BP3、KIAA1429、METTL3、EIF3H和LRPPRC表達(dá)的m6A評(píng)分被報(bào)道為胰腺腫瘤微環(huán)境狀態(tài)的指標(biāo)，是患者預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。METTL3在多種癌癥組織中的表達(dá)水平顯著升高，與患者的不良預(yù)后有關(guān)。此外，證據(jù)還表明m6A甲基化相關(guān)基因的表達(dá)譜是代謝異常和心血管疾病的候選生物標(biāo)志物。然而，到目前為止，還沒有研究直接評(píng)估RNA m6A修飾本身作為生物標(biāo)志物的能力。據(jù)我們所知，這是第一項(xiàng)評(píng)估特定基因的RNA m6A甲基化水平作為生物標(biāo)志物的應(yīng)用的研究，不僅限于輻射相關(guān)的生物標(biāo)志物。綜上所述，我們系統(tǒng)地篩選和評(píng)估了RNA m6A修飾在輻射劑量評(píng)估中的可行性。特別是m6A修飾NCOA4在劑量反應(yīng)性、時(shí)間動(dòng)力學(xué)、反應(yīng)特異性和跨物種保守性方面的突出表現(xiàn)，表明其在輻射事故管理和臨床應(yīng)用中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

研究者進(jìn)一步通過在小鼠、猴子和人類中的保守性分析發(fā)現(xiàn)，上述三個(gè)基因均具有跨物種高度保守的m6A修飾位點(diǎn)。尤其是，基于NCOA4基因中的保守m6A修飾位點(diǎn)，研究者分別建立了恒河猴、人類細(xì)胞系及人類PBMC的輻射暴露模型，發(fā)現(xiàn)在非人靈長(zhǎng)類和人類中NCOA4 m6A修飾水平仍然具有良好的量效關(guān)系。此外，研究者招募了33例接受局部放射治療的腫瘤患者，發(fā)現(xiàn)這些患者接受不同劑量放射治療后其PBMC中NCOA4 m6A修飾水平與受照劑量也具有良好的量效關(guān)系。

最后，研究者利用多因素非線性回歸模型構(gòu)建了基于NCOA4/Ncoa4 m6A修飾水平的輻射暴露劑量預(yù)測(cè)模型，可前瞻性準(zhǔn)確預(yù)測(cè)小鼠或人體吸收的輻射劑量。例如，該模型對(duì)于小鼠受照劑量的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度高達(dá)96.6%，對(duì)于臨床放療患者的受照劑量預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度達(dá)到90.1%?？傊?，這項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)了多個(gè)基于RNA m6A修飾的候選輻射暴露標(biāo)志物，并建立了基于這些修飾的人體輻射暴露劑量預(yù)測(cè)模型，證明了RNA m6A修飾在輻射受照人員醫(yī)學(xué)分類和臨床應(yīng)用中的潛在可行性。

基于Ncoa4 m6A修飾水平的輻射暴露劑量預(yù)測(cè)模型

軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院周鋼橋研究員和盧一鳴副研究員為論文的共同通訊作者；軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院陳紅霞副研究員、趙曦博士和解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心放射治療科楊微主治醫(yī)師為本文的共同第一作者。

為了進(jìn)一步高效檢測(cè)上述新發(fā)現(xiàn)的NCOA4 m6A修飾標(biāo)志物，軍事醫(yī)學(xué)研究院周鋼橋/盧一鳴團(tuán)隊(duì)與北京航空航天大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院常凌乾課題組合作，近日又在 Biosensors & Bioelectronics期刊上發(fā)表了題為“Sensitive, rapid detection of NCOA4-m6A towards precisely quantifying radiation dosage on a Cas13a-Microdroplet platform ”的研究論文。

該研究針對(duì)NCOA4 m6A修飾位點(diǎn)進(jìn)行靶向設(shè)計(jì)，并基于CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)設(shè)計(jì)了一種新型液滴微流控芯片系統(tǒng)（Cas13a-液滴微流控芯片平臺(tái)）。在原理上，該 Cas13a-液滴微流控芯片平臺(tái)可產(chǎn)生均勻的微液滴，每個(gè)液滴中包裹了NCOA4 m6A和CRISPR/Cas13a檢測(cè)系統(tǒng)。其中，Cas13a可識(shí)別NCOA4 m6A修飾位點(diǎn)并進(jìn)一步切割熒光報(bào)告分子，在20分鐘內(nèi)即可產(chǎn)生放大的熒光信號(hào)，通過計(jì)量陽(yáng)性液滴數(shù)的比例即可實(shí)現(xiàn)直觀的定量。此外，該平臺(tái)可使反應(yīng)體積從微升（μL）級(jí)減少到皮升（pL）級(jí)，從而能在比傳統(tǒng)方法更低的靶標(biāo)濃度下實(shí)現(xiàn)高度靈敏的定量檢測(cè)。該平臺(tái)的靈敏度和快速反應(yīng)性在受照小鼠模型和臨床放療患者樣本中都得到了驗(yàn)證。此外，與經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)室級(jí)別的m6A檢測(cè)方法MeRIP-qPCR相比，該微流控芯片平臺(tái)檢測(cè)NCOA4 m6A的靈敏度增加了兩倍?？傊娛箩t(yī)學(xué)研究院和北航兩個(gè)團(tuán)隊(duì)跨學(xué)科合作開發(fā)的 Cas13a-液滴微流控芯片平臺(tái)能夠?qū)崿F(xiàn)人體受照電離輻射劑量的快速、高靈敏度和高通量檢測(cè)，為輻射暴露人員受照劑量的高通量測(cè)定和醫(yī)學(xué)分類提供了全新的技術(shù)手段。

Cas13a-液滴微流控芯片平臺(tái)通過檢測(cè)NCOA4 m6A水平來確定輻射劑量的原理示意圖

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