華南理工大學(xué)曹曉東、董華團(tuán)隊(duì)《先進(jìn)功能材料》：具有可注射和自組裝功能的微凝膠用于軟骨修復(fù)新策略
原創(chuàng)： 高分子科學(xué)前沿
干細(xì)胞注射和組織工程（如MACI技術(shù)）是目前治療軟骨缺損的主要方法，但它們均存在明顯不足：如干細(xì)胞注射后細(xì)胞滯留率和存活率低；MACI技術(shù)會造成較大的手術(shù)創(chuàng)面，且難以完整填充不規(guī)則缺損等。傳統(tǒng)可注射水凝膠雖然可以實(shí)現(xiàn)微創(chuàng)治療并有效填充不規(guī)則缺損，但細(xì)胞在注射過程中會受到較大的剪切應(yīng)力，除此之外，凝固后的水凝膠支架內(nèi)部沒有大孔結(jié)構(gòu)，營養(yǎng)供給不充分，這些都容易引起細(xì)胞凋亡，影響軟骨再生。針對上述問題，華南理工大學(xué)曹曉東教授和董華教授團(tuán)隊(duì)基于bottom-up的理念，提出了軟骨修復(fù)的新策略（圖1）。該策略的主要思路如下：將巰基化明膠 (Gel-SH)、乙烯砜化透明質(zhì)酸 (HA-VS) 和間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）在微流控芯片中共混，通過thiol-Michael加成反應(yīng)形成包載BMSCs的可注射Gel-HA微凝膠（圖2和圖3）；培養(yǎng)一段時(shí)間后(圖4)，將此微凝膠注射到組織缺損位置，由于此時(shí)絕大多數(shù)干細(xì)胞都被微凝膠包裹，因而注射后的細(xì)胞滯留率和存活率較高（圖5），待干細(xì)胞在體內(nèi)大量增殖后，微凝膠借助其表面干細(xì)胞間的相互作用可自組裝成大孔微凝膠支架，而后進(jìn)一步分化成類軟骨組織（圖6）。該策略很好地解決了現(xiàn)有軟骨修復(fù)方法存在的諸多問題，為軟骨修復(fù)提供了一個(gè)全新的思路。
圖1：基于干細(xì)胞載體Gel-HA微凝膠的軟骨修復(fù)策略示意圖。
(a) 以Gel-SH和HA-VS為預(yù)聚物，通過thiol-Michael加成反應(yīng)，采用微流控技術(shù)制備包載BMSCs的Gel-HA微凝膠；(b) 體外培養(yǎng)包載BMSCs的微凝膠；(c) 包載BMSCs的微凝膠注射到缺損位置并以bottom-up的方式實(shí)現(xiàn)自組裝。
圖2：微凝膠材料的制備和表征
（a）Gel-SH、HA-VS和Gel-HA水凝膠的合成路線；（b）Gel-SH和HA-VS的1H NMR譜圖；（c）Gel-HA水凝膠的FTIR光譜；（d-f）不同濃度的HA-VS / Gel-SH的Gel-HA水凝膠的物理表征，包括（d）成膠時(shí)間，（e）應(yīng)力應(yīng)變曲線和（f）流變性能表征。
圖3：微流控技術(shù)制備包載BMSCs的Gel-HA微凝膠
（a）在微流控芯片中制備包載BMSCs的Gel-HA微球；（b）分散相和連續(xù)相的流速比對微凝膠尺寸的影響；（c）包載BMSC的Gel-HA微凝膠的光學(xué)相片和細(xì)胞數(shù)量分布。
圖4：包載BMSC的Gel-HA微凝膠的體外生物學(xué)表征。
（a）微凝膠內(nèi)BMSCs的活死染色和CCK-8測定；（b）BMSCs在Gel-HA微凝膠中的分布 (按7:3的比例將Gel-HA微凝膠分為的面積相等的核層和殼層，用DAPI對細(xì)胞核染色并用CLSM觀察)；（c）包載BMSC的Gel-HA微凝膠的免疫組化染色和mRNA表達(dá)測試（在mRNA表達(dá)圖中，黑色代表沒有在軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的未包封在微凝膠中的BMSCs，紅色代表沒有在軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的包封在微凝膠中的BMSCs，藍(lán)色代表在軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的包封在微凝膠中的BMSCs）。
圖5：包載BMSCs的Gel-HA微凝膠在體外實(shí)現(xiàn)可注射和自組裝
a）將包載BMSCs的微凝膠注射進(jìn)PDMS空腔模具中在體外完成自組裝的過程演示；（b）在不同注射速度下，BMSCs的活死染色和定量分析；（c）微凝膠自組裝體的表征：（左）在低（4×106 / mL）和高（1.2×107 / mL）細(xì)胞密度下，完成自組裝過程的效率；（右）細(xì)胞骨架染色以及Col I、Col Ⅱ、aggrecan的免疫熒光染色。
圖6：包載BMSCs的Gel-HA微凝膠在動物體內(nèi)實(shí)現(xiàn)可注射和自組裝
(a) 體內(nèi)移植體的尺寸變化：右側(cè)為包載BMSCs的微凝膠，左側(cè)為純BMSCs懸液（對照組）；(b) 移植體的實(shí)物圖；(c) 移植體的機(jī)械強(qiáng)度；(d) 通過CD31的免疫熒光染色表征移植體的血管化（CD31：紅色，細(xì)胞核：藍(lán)色）；(e) 通過Col X的免疫組化染色表征移植體的肥大化。
相關(guān)論文以“Injection and Self‐Assembly of Bioinspired Stem Cell‐Laden Gelatin/Hyaluronic Acid Hybrid Microgels Promote Cartilage Repair In Vivo”發(fā)表在《Advanced Functional Materials》。博士生馮琦為該文章第一作者，曹曉東教授和董華教授為通訊作者，華南理工大學(xué)為論文唯一完成單位。
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