Analyst：數(shù)字PCR數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確、可靠、非監(jiān)督自動(dòng)分類新方法
清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程系郭永實(shí)驗(yàn)室在《分析學(xué)家》（Analyst）在線以封底（back cover）發(fā)表題為《一種雙熒光四分類微液滴數(shù)字PCR數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確、可靠和自動(dòng)分類方法——密度分水嶺算法》（A density-watershed algorithm (DWA) method for robust， accurate and automatic classification of dual-fluorescence and four-cluster droplet digital PCR data）的研究論文，該研究將微液滴數(shù)字PCR的數(shù)據(jù)密度分布與分水嶺算法（一種圖像分割方法）有機(jī)結(jié)合，建立了一種微液滴數(shù)字PCR數(shù)據(jù)非監(jiān)督分類的新方法。
微液滴數(shù)字PCR是一種單分子水平的核酸定量分析技術(shù)。通過將PCR反應(yīng)體系分割為大量的微液滴，絕大多數(shù)微液滴內(nèi)僅含有0個(gè)或1個(gè)模板分子，含有模板分子的微液滴在PCR擴(kuò)增后呈現(xiàn)出較強(qiáng)的熒光信號(hào)。通過微液滴內(nèi)熒光的檢測，可以得到微液滴數(shù)字PCR數(shù)據(jù)。依據(jù)熒光強(qiáng)度對(duì)該數(shù)據(jù)進(jìn)行分類，即可判斷出含有模板分子的微液滴的數(shù)量和比例，最終通過泊松分布統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算，得到模板分子的絕對(duì)拷貝數(shù)。在上述過程中，微液滴數(shù)字PCR數(shù)據(jù)的分類是關(guān)鍵步驟，它直接影響到統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算的輸入，因而決定著微液滴數(shù)字PCR定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。
目前，微液滴數(shù)字PCR的數(shù)據(jù)分類方法主要有兩種：一種是針對(duì)每種反應(yīng)定制的監(jiān)督分類算法，這些算法具有較高的準(zhǔn)確性，但是針對(duì)不同的樣本類型和檢測指標(biāo)，需要開發(fā)多種不同的分類算法；另一種是通用的非監(jiān)督分類算法，但是它們的準(zhǔn)確性和可靠性都不盡如人意，且時(shí)常會(huì)出現(xiàn)假陰性和假陽性的檢測結(jié)果。為了解決上述不足，研究人員模擬人眼對(duì)微液滴數(shù)字PCR數(shù)據(jù)的分類過程，將微液滴數(shù)字PCR數(shù)據(jù)作為一幅圖像，提出了一種新型的數(shù)據(jù)分類方法——密度分水嶺算法。該方法通過數(shù)據(jù)密度分布的判斷，使用分水嶺算法自動(dòng)地、非監(jiān)督地將網(wǎng)格化（圖像化）的微液滴數(shù)字PCR數(shù)據(jù)沿著數(shù)據(jù)相對(duì)稀疏的位置分割為若干區(qū)域，最后通過這些區(qū)域的邊界實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、可靠、自動(dòng)的非監(jiān)督數(shù)據(jù)分類（圖1）。研究人員將密度分水嶺算法與現(xiàn)有主流商業(yè)化算法進(jìn)行了比較，在人類表皮生長因子受體（EGFR）的L858R和T790M突變位點(diǎn)的檢測方面，密度分水嶺算法實(shí)現(xiàn)的檢測限是現(xiàn)有主流商業(yè)化算法的1/40，顯著地提高了微液滴數(shù)字PCR自動(dòng)化檢驗(yàn)的檢測能力。研究人員進(jìn)一步使用Bio-Rad QX200和新羿TD-1兩種微液滴數(shù)字PCR系統(tǒng)，在254例冰凍組織、石蠟包埋組織和外周血臨床樣本上驗(yàn)證了密度分水嶺算法，其中絕大部分（>84%）臨床樣本的定量結(jié)果優(yōu)于現(xiàn)有主流商業(yè)化算法，且全部臨床樣本未出現(xiàn)假陰性和假陽性的檢測結(jié)果。該研究為微液滴數(shù)字PCR的臨床應(yīng)用提供了一種新的自動(dòng)化數(shù)據(jù)分析思路，有望用于臨床的全自動(dòng)核酸絕對(duì)定量。隨著精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展，開發(fā)準(zhǔn)確、可靠、全自動(dòng)的單拷貝核酸定量分析方法對(duì)于疾病的篩查、診斷、用藥指導(dǎo)、病情監(jiān)測和預(yù)后均具有重要意義。
來源：生物谷
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