由于細(xì)胞之間的異質(zhì)性，不同的細(xì)胞對某些藥物有不同的反應(yīng)。盡管使用傳統(tǒng)小型化微量滴定板進(jìn)行藥物篩選已經(jīng)很好地建立起來并且易于執(zhí)行，但單細(xì)胞藥物篩選仍然面臨一些技術(shù)障礙，包括在開放環(huán)境中分散液體的不受控制的蒸發(fā)。傳統(tǒng)的小型化微滴定板只能靜態(tài)培養(yǎng)細(xì)胞，這限制了它們的適用性，因?yàn)檫@種方法無法模擬自然的細(xì)胞外微環(huán)境。相比之下，微流體裝置可以通過連續(xù)輸注進(jìn)行3D細(xì)胞培養(yǎng)，使其能夠模擬體內(nèi)與細(xì)胞生理學(xué)相關(guān)的微環(huán)境，同時(shí)具有低樣品消耗、低成本和高通量的優(yōu)點(diǎn)。Brouzes等人提出了一種基于液滴的微流體裝置，可以實(shí)現(xiàn)藥物庫對U937細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。在他們的方法中，他們首先用獨(dú)特的熒光標(biāo)記藥物濃度庫，并將其與含有單細(xì)胞的液滴結(jié)合。將合并的液滴孵育24小時(shí)，然后注射到另一個(gè)設(shè)備中，與含有細(xì)胞活性熒光染料的液滴融合，然后在芯片上短暫孵育。最后，進(jìn)行熒光分析以揭示單細(xì)胞的異質(zhì)性。由于其精確的細(xì)胞包封、高通量液滴的產(chǎn)生和操作，以及用于聯(lián)合篩選的潛力，該設(shè)備代表了單細(xì)胞藥物篩選的理想平臺。最近，Scheler等人開發(fā)了一種基于液滴的數(shù)字最小抑菌濃度篩選，作為量化抗生素表型反應(yīng)的單細(xì)胞分布的實(shí)用分析平臺，并允許高精度地測量接種物效應(yīng)（圖8A）。根據(jù)頭孢噻肟治療攜帶β-內(nèi)酰胺酶的大腸桿菌的結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)抗生素療效取決于每個(gè)細(xì)菌菌落形成單位使用的抗生素量，而不是絕對抗生素濃度。

與流式細(xì)胞術(shù)分析不同，單細(xì)胞藥物篩選試驗(yàn)是使用微滴方法進(jìn)行的，其中將選定的化合物添加到分離的單個(gè)細(xì)胞中，而不是添加到細(xì)胞群中。這使得細(xì)胞之間的相互作用得以避免，并且由于不同的細(xì)胞對藥物具有不同的敏感性，因此有可能從細(xì)胞群中分離出耐藥細(xì)胞以進(jìn)行進(jìn)一步分析，從而有可能為癌癥早期治療的新藥開發(fā)提供條件。例如，Sarkar等人使用集成微流體液滴陣列平臺分析了阿霉素在野生型和耐阿霉素乳腺癌癥細(xì)胞中的攝取和細(xì)胞毒性（圖8B）。他們發(fā)現(xiàn)，在存在或不存在阿霉素（Dox）的情況下，藥敏細(xì)胞比耐藥細(xì)胞更容易死亡。他們還觀察到單個(gè)藥物敏感細(xì)胞的多相攝取，而耐藥細(xì)胞的攝取和保留率較低。Bithi等人提出了一種基于移液管的微流體細(xì)胞分離技術(shù)，用于生成微滴陣列。他們的平臺可用于小樣本體積內(nèi)少量腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞簇的單細(xì)胞藥物分析。他們使用該平臺對腫瘤細(xì)胞對阿霉素的反應(yīng)進(jìn)行了單細(xì)胞分析，發(fā)現(xiàn)盡管單個(gè)腫瘤細(xì)胞的藥物攝取不同，但凋亡的發(fā)生是由阿霉素關(guān)鍵細(xì)胞內(nèi)濃度的積累決定的。他們的方法為理解腫瘤細(xì)胞-藥物相互作用提供了一個(gè)理想的平臺。

單細(xì)胞遺傳分析

細(xì)胞之間的遺傳差異在發(fā)育、分化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和疾病中非常顯著，開發(fā)單細(xì)胞基因分析方法來探索這些生命過程非常重要。除了單細(xì)胞分離外，液滴微流體還成為分離單細(xì)胞基因組的有前景的工具，使其成為細(xì)胞生物學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)單細(xì)胞基因組學(xué)高通量研究的理想技術(shù)。

Lan等人描述了一種使用微流控液滴技術(shù)進(jìn)行超高通量單細(xì)胞基因組測序的方法（圖9A）。在他們的方法中，單個(gè)細(xì)胞被包裹在微凝膠中，微凝膠可以滲透酶、洗滌劑和水力直徑小于其孔徑的小分子等分子，但也可以在空間上捕獲基因組DNA等大分子。微凝膠的使用有助于清潔包封的細(xì)胞，以執(zhí)行必要的步驟，如細(xì)胞裂解和基因組處理，同時(shí)保持單個(gè)基因組的分離。使用他們的方法，他們很容易對包封的細(xì)胞進(jìn)行一系列操作，如細(xì)胞裂解和基因組處理，同時(shí)保持單個(gè)基因組之間的分區(qū)。通過將微凝膠和微流控液滴技術(shù)相結(jié)合，他們的方法可以在短時(shí)間內(nèi)處理5萬個(gè)細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)超高通量單細(xì)胞基因組測序。然而，它們的封裝過程遵循泊松分布，導(dǎo)致封裝率低。此外，Moon等人開發(fā)了一種新的液滴微流體平臺，其中含有寡核苷酸條形碼的高濃度微珠在慣性作用下自發(fā)排列在螺旋通道中，然后與液滴中的單個(gè)細(xì)胞共封裝以進(jìn)行單細(xì)胞測序（圖9B）。通過慣性有序珠的確定性封裝，他們的平臺顯著提高了吞吐量并減少了條形碼錯(cuò)誤，相對于非確定性Drop-seq系統(tǒng)，顯著減少了多珠包裝中的間歇性錯(cuò)誤。Guo等人開發(fā)了一種快速、無PCR的單細(xì)胞miRNA檢測方法，在帶有光電倍增管（PMT）傳感器的液滴微流體平臺中使用DNA雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增靶miRNA信號（圖9C），其中單細(xì)胞和裂解物被包裹在液滴中，單個(gè)細(xì)胞釋放的靶miRNA與DNA放大器相互作用，引發(fā)雜交反應(yīng)并產(chǎn)生熒光信號。靶序列在不使用PCR熱循環(huán)的情況下循環(huán)，以顯著放大熒光信號。他們的方法有效地將實(shí)驗(yàn)室臺式PCR分析轉(zhuǎn)化為實(shí)時(shí)液滴分析，使用反應(yīng)后熒光進(jìn)行讀取，以實(shí)現(xiàn)超高通量單細(xì)胞測序（每分鐘300-500個(gè)細(xì)胞），用于快速生物醫(yī)學(xué)鑒定。此外，Segaliny等人報(bào)道了一種單細(xì)胞液滴微流體方法，通過動態(tài)監(jiān)測TCR T細(xì)胞活化、逆轉(zhuǎn)錄PCR和單細(xì)胞水平的TCR鏈測序來鑒定表達(dá)工程化T細(xì)胞受體（TCR）的T細(xì)胞。

最近，基于單細(xì)胞液滴微流體的遺傳分析越來越多地被研究學(xué)者應(yīng)用于臨床診斷。Rivello等人描述了一種研究與轉(zhuǎn)移性疾病相關(guān)的循環(huán)基質(zhì)細(xì)胞代謝的通用方法，以使用基于液滴的微流體芯片揭示前列腺癌癥的預(yù)后。他們對轉(zhuǎn)移性癌癥前列腺患者的單細(xì)胞進(jìn)行液滴內(nèi)細(xì)胞外pH測量，以檢測和分離高代謝活性細(xì)胞（HMCs）。然后對HMCs進(jìn)行單細(xì)胞mRNA測序分析，結(jié)果顯示約87%是高代謝的循環(huán)基質(zhì)細(xì)胞。Kaplan-Meier分析顯示，HMCs超過5的患者的生存概率明顯低于HMCs少于5的患者。因此，HMCs可能是癌癥預(yù)后不良的指標(biāo)。單細(xì)胞液滴微流體方法對前列腺癌癥的診斷具有潛在的實(shí)用性。此外，王的團(tuán)隊(duì)建立了一個(gè)基于單細(xì)胞液滴的微流體系統(tǒng)，用于臨床尿液樣本的病原體鑒定和抗菌藥物敏感性測試（圖9D）。使用153個(gè)熒光雜交探針檢測微滴中單個(gè)細(xì)菌的16S核糖體RNA（16S rRNA），從而在16分鐘內(nèi)從臨床尿液樣本中分子鑒別尿致病菌，并定量指示細(xì)菌對抗生素的敏感性。微流體系統(tǒng)在短周轉(zhuǎn)時(shí)間（<30分鐘）內(nèi)實(shí)現(xiàn)了尿液病原體分析的卓越性能。使用基于液滴的微流體對臨床樣本中的單細(xì)胞進(jìn)行多樣性遺傳分析，對于加速臨床診斷/治療和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展非常有價(jià)值。

在這篇綜述中，我們介紹并討論了單細(xì)胞液滴微流體在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用方面的最新進(jìn)展。微流體液滴技術(shù)從重要優(yōu)勢、無量綱數(shù)、裝置幾何形狀和液滴產(chǎn)生等方面進(jìn)行了介紹。描述并討論了基于隨機(jī)或受控模式在液滴中以及使用合成或天然聚合物在水凝膠中用于單細(xì)胞包封的各種最新微流控液滴操縱方法。最后，我們總結(jié)了單細(xì)胞液滴微流體在小分子檢測、蛋白質(zhì)分析、藥物篩選和遺傳分析中的重要應(yīng)用。

盡管使用微流控液滴技術(shù)在單細(xì)胞操作和分析方面取得了一些進(jìn)展，但仍然存在瓶頸。首先，微流控液滴技術(shù)的單細(xì)胞包封率較低，用于單細(xì)胞分析的檢測工具在數(shù)量上仍然有限，靈敏度相對較低。開發(fā)更簡單、更便宜、更集成的液滴微流體裝置將顯著改善單細(xì)胞分析。此外，用于包封單細(xì)胞的凝膠材料在功能上是有限的，有必要開發(fā)用于培養(yǎng)的多復(fù)合/功能凝膠材料，以有效地重建體內(nèi)細(xì)胞的3D微環(huán)境，用于單細(xì)胞的高通量分析。最后，細(xì)胞本身的復(fù)雜性以及單細(xì)胞分析的當(dāng)前趨勢涉及多模式表征的事實(shí)，鼓勵(lì)了同步檢測更多類型細(xì)胞間分子的方法的發(fā)展。這些挑戰(zhàn)將促進(jìn)液滴微流體在操作和檢測目的以及多組分單細(xì)胞分析中的進(jìn)一步發(fā)展，為單細(xì)胞的進(jìn)一步生物醫(yī)學(xué)研究提供科學(xué)依據(jù)，并導(dǎo)致對生物過程中涉及的分子的功能和調(diào)控機(jī)制的更準(zhǔn)確和全面的理解。

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