單細胞異質(zhì)性在生理學、腫瘤學、神經(jīng)生物學、臨床診斷和治療等各個生物醫(yī)學領(lǐng)域都得到了強調(diào)。先前微流控策略的方法學發(fā)展已經(jīng)實現(xiàn)了動態(tài)單細胞操作、監(jiān)測和分析。由于其高通量、可控尺寸和獨立成分的使用，微流控液滴技術(shù)作為生物醫(yī)學應(yīng)用中基于細胞的高通量分析工具，如蛋白水解活性檢測、細胞因子分泌、和基因測序，引起了極大的關(guān)注。在這里，我們回顧了過去六年中在生物醫(yī)學領(lǐng)域引入的單細胞液滴應(yīng)用，包括小分子檢測、蛋白質(zhì)分析、藥物篩選分析和遺傳分析。

單細胞小分子檢測

在單細胞分析中檢測小分子是更好地了解生物體、探索細胞異質(zhì)性和早期診斷疾病的必要策略。細胞間小分子物質(zhì)，如乳酸和活性氧，廣泛參與細胞的信號通路，在許多生理和病理過程中起著重要作用。例如，癌癥的一個顯著特征是高葡萄糖代謝和乳酸生成。癌癥細胞通過有氧糖酵解將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸，這在細胞信號激活、增殖和疾病進展中起著重要作用。單細胞液滴微流體最近被應(yīng)用于檢測這些小分子。Mongersun等人提出了一種液滴微流體方法，其中使用被動力將液滴包封的細胞放置到陣列中。該方法可以快速定量地確定許多單細胞中乳酸的釋放。通過使用商業(yè)乳酸試劑盒將乳酸轉(zhuǎn)化為熒光產(chǎn)品，單細胞中乳酸鹽的釋放速率由液滴熒光的增加決定?；谶@種方法，他們開發(fā)了一種方法來確定K562白血病和U87膠質(zhì)母細胞瘤細胞在化學抑制乳酸流出條件下乳酸釋放的細胞間差異，這為研究高度異質(zhì)性的細胞群提供了一種新工具。Scoles小組在同一年使用帶有T連接通道的微流控液滴裝置也證明了轉(zhuǎn)移患者單個循環(huán)腫瘤細胞（CTC）中乳酸的熒光檢測。他們從20萬個血細胞中檢測到了10個腫瘤細胞。這項工作為涉及代謝的單一CTC識別提供了概念驗證。

最近，徐的團隊開發(fā)了一種表面增強拉曼散射（SERS）-微流控液滴平臺，通過由銀納米粒子修飾的Fe3O4磁性微球組成的多功能磁性SERS底物，在單細胞水平上實現(xiàn)了多重代謝物的無標記同時分析（圖6A）。他們實現(xiàn)了三種單細胞代謝物的無標簽、無損、同時測定：丙酮酸、三磷酸腺苷和乳酸。他們的金屬磁性復合基質(zhì)可用于實現(xiàn)單細胞代謝物的有效吸附和從復雜基質(zhì)中的快速分離，并且具有很高的SERS靈敏度，使SERS微滴平臺成為在代謝水平上探索單細胞異質(zhì)性的有力工具。單細胞液滴也可以根據(jù)小分子動力學進行分類。Zielke等人開發(fā)了一種液滴微流體裝置，用于基于糖酵解分離癌癥細胞亞群，這種方法不需要使用標記物或活性分選成分。他們的技術(shù)用于控制特定表面活性劑環(huán)境下癌癥乳腺細胞糖酵解過程中質(zhì)子的分泌，以降低液滴的pH值。隨著液滴pH值的降低，液滴的界面張力增加，使不同糖酵解水平的細胞能夠分離。由于癌癥細胞暴露在不同的氧氣和營養(yǎng)環(huán)境中，它們的糖酵解反應(yīng)不同。該方法可用于根據(jù)選定的代謝差異將癌癥細胞與正常細胞分離，并鑒定具有相似物理特征的細胞。

細胞內(nèi)活性氧，如超氧陰離子和過氧化氫（H2O2），參與免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)、細胞生長和遷移、代謝調(diào)節(jié)、重要生物物質(zhì)合成和其他生理過程。劉的團隊開發(fā)了一種高靈敏度的液滴微流體方法，用于定量測定不同類型的單細胞與金納米簇結(jié)合分泌的H2O2（圖6B）。單細胞分泌的130 H2O2可以誘導辣根過氧化物修飾的金納米簇發(fā)生顯著的熒光變化。他們的研究結(jié)果表明，快速生長的癌癥細胞可以產(chǎn)生比正常細胞系具有更高H2O2含量的分泌物，這為研究單細胞水平上H2O2分泌的細胞間差異提供了有用的工具。

抗壞血酸（AA），也稱為維生素C，是一種強抗氧化劑和酶反應(yīng)中的輔因子，可以預(yù)防自由基誘導的疾病，特別是帕金森病和癌癥。AA可以有效地清除與多種形式的組織損傷和疾病相關(guān)的有毒自由基和其他活性氧，這有助于開發(fā)簡單、快速和簡單的分析方法，用于高度選擇性和可靠地測量AA。最近，Alizadeh等人報道了一種液滴微流體方法，用于活細胞中AA的細胞內(nèi)成像（圖6C）。通過分離小微滴，他們能夠快速檢測和成像單個細胞中的AA。他們的傳感系統(tǒng)基于非氧化還原策略，其中應(yīng)用了熒光聚合物納米復合材料。他們的技術(shù)為研究單細胞提供了一種穩(wěn)健的方法和理想的平臺，并為臨床評估中的分子傳導生物學檢測提供了一個有前景的新工具。

4.2單細胞蛋白質(zhì)分析

蛋白質(zhì)是一種在活細胞中具有特定功能的生物大分子，與細胞行為和代謝的特異性直接相關(guān)。不同細胞中表達的蛋白質(zhì)具有明顯的異質(zhì)性，單個細胞內(nèi)有許多類型的蛋白質(zhì)。盡管蛋白質(zhì)類型豐富，但具有重要功能的蛋白質(zhì)數(shù)量非常少。因此，基于單細胞的特異性蛋白質(zhì)的定量分析對于揭示群體中細胞的異質(zhì)性以改善由單細胞或一小組細胞引起的疾病（如癌癥）的早期診斷是非常重要的。流式細胞術(shù)是經(jīng)典的單細胞蛋白分析方法，可以通過免疫標記各種功能蛋白來檢測特定功能蛋白的含量。然而，由于分泌蛋白的豐度低、缺乏足夠的靈敏度和細胞固定的要求，基于傳統(tǒng)流式細胞儀對單細胞分泌的特定蛋白進行動態(tài)檢測和分析仍然具有挑戰(zhàn)性。微液滴技術(shù)因其體積小、檢測靈敏度高、通量大，在單細胞蛋白質(zhì)分析中具有廣闊的應(yīng)用前景。在下文中，我們討論了單細胞分泌的酶和細胞因子等蛋白質(zhì)的定量分析，以表達細胞群的異質(zhì)性。

在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，惡性腫瘤細胞突破周圍的生理屏障并遷移。腫瘤細胞和免疫細胞在體內(nèi)具有不同的遷移能力。基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等分泌產(chǎn)物代表了有前景的藥物靶點和候選生物標志物，并為評估癌癥轉(zhuǎn)移提供了有價值的信息，并基于對其活性的分析，允許篩選新的藥物來調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和腫瘤發(fā)生。 Yu等人報道了一種微流體方法，用于使用流動聚焦毛細管微流體設(shè)備檢測單個腫瘤細胞液滴中MMP9（MMPs的明膠酶亞群）酶活性（圖7A）。細胞分泌的MMP9能夠切割一對熒光團/猝滅分子（FITC和DABCYL）修飾的肽。這可用于測量微滴中MMP9酶在熒光強度方面的活性，從而能夠以高再現(xiàn)性定量分析單個癌癥細胞分泌的MMP9的蛋白水解活性，以評估癌癥細胞的侵襲功能。該方法在檢測細胞侵襲性方面的超高靈敏度使其適用于細胞診斷和癌癥研究的高通量篩選。然而，由于載體油的流動性，現(xiàn)有的基于液滴的單細胞基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）分析方法很少能夠連續(xù)跟蹤液滴的蛋白水解含量。為了改善這一點，Mu的團隊描述了使用熱固性油通過一個過程實時監(jiān)測液滴的MMP分析，在這個過程中，液滴在形成后通過轉(zhuǎn)化為固體而固定（圖7B）。這種方法可以實時監(jiān)測單細胞蛋白水解活性，而不會損害液滴微流體的靈活性，從而可以根據(jù)實時熒光曲線計算反應(yīng)速率。該過程揭示的MMP活性的明顯細胞異質(zhì)性表明其在其他類型的基于細胞的高分辨率動態(tài)信息分析中的應(yīng)用潛力。

哺乳動物細胞（如免疫細胞、內(nèi)皮細胞和癌癥細胞）分泌的細胞因子在感染、免疫反應(yīng)、炎癥和疾病發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。特別是，細胞因子表達的增加與腫瘤血管形成和生長有關(guān)，這反過來可以產(chǎn)生新的腫瘤血管并擴增現(xiàn)有的腫瘤血管。 Hsu等人建立了一種微流體液滴系統(tǒng)，用于高靈敏度的單細胞多重分泌組分析。和單核細胞趨化蛋白-1。該系統(tǒng)還可以在60分鐘內(nèi)測定6000個細胞的細胞分泌物的顯著異質(zhì)性。此外，徐的小組建立了SERS液滴微流體平臺，用于快速、超敏和同時檢測單個癌癥細胞分泌的細胞因子，包括血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和IL-8（圖7C）。他們的結(jié)果表明，細胞與細胞的相互作用可以通過上調(diào)VEGF和IL-8來促進癌癥細胞的血管生成。這種方法的高靈敏度源于金屬等離子體增強和磁場誘導聚集的放大效應(yīng)，這使得含有單個細胞和四個免疫顆粒的油滴中形成高通量的水包水成為可能。此外，可以根據(jù)不同的排泄能力進行細胞分選，以探索單細胞釋放細胞因子的細胞間異質(zhì)性。這項技術(shù)為理解各種細胞因子在腫瘤血管化和侵襲性腫瘤生長中的生物學作用提供了一種新方法。最近，Wimmers等人提出了一種微流體單細胞液滴系統(tǒng)，用于免疫熒光檢測人漿細胞樣樹突狀細胞（pDC）中I型干擾素（IFN）的產(chǎn)生。I型IFN是與感染和癌癥相關(guān)的免疫的關(guān)鍵細胞因子。他們的結(jié)果支持I型干擾素的產(chǎn)生僅限于少量單獨刺激的pDCs，并表明pDC驅(qū)動的I型干擾素產(chǎn)生存在隨機差異。此外，袁等人使用微流體裝置將單個自然殺傷NK-92 MI細胞及其K562靶細胞快速包封到微滴中，以提高單個細胞分泌IFN-γ的能力。微滴包封可以防止分泌物擴散到相鄰細胞，并顯著降低非微流體微滴方法下獲得的假陽性和陰性率。

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