摘 要 適配體(Aptamer)是通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術( SELEX)篩選得到的,可與靶標分子以高親和力特異性結合的單鏈 DNA 或 RNA,在生物分離分析、臨床診斷和疾病靶向治療等領域應用廣泛。 適配體的發(fā)展與篩選技術的進步密切相關,以 SELEX 為基礎,研究者開發(fā)了磁珠 SELEX 和毛細管電泳 SELEX 等多種適配體體外篩選技術,但這些方法存在篩選輪次多、篩選周期長和樣品消耗量大、對小分子篩選效率低等缺點。 微流控芯片具有體積小、高通量和易集成等特點,基于微流控芯片的 SELEX 技術在一定程度上可解決上述問題,實現(xiàn)適配體快速、高通量的體外篩選。 本文在總結 SELEX 及其關鍵技術要點的基礎上,重點評述了基于微流控和微陣列芯片 SELEX 技術的研究進展,并對 SELEX 技術中未來的發(fā)展方向進行了總結和展望。

適配體 是 通 過 指 數(shù) 富 集 的 配 體 系 統(tǒng) 進 化 技 術 ( Systematic evolution of ligands by exponentialenrichment, SELEX)在體外篩選得到的一段寡聚核糖核苷酸(RNA)或單鏈脫氧核糖核苷酸(ssDNA)序列,與靶標分子之間具有特異性相互作用,借助范德華力、氫鍵、疏水作用和靜電作用等分子間作用力,折疊成復雜穩(wěn)定的 3D 結構,如莖環(huán)、發(fā)夾和 G 四鏈體等。自 1990 年 Ellington和 Tuerk從含有 10¹⁵種寡核苷酸文庫中篩選出 RNA 適配體以來,研究者陸續(xù)篩選出許多適配體,其靶標范圍覆蓋了金屬離子、三磷酸腺苷(ATP)、氨基酸等小分子物質; 生長因子和細胞粘附分子等蛋白質以及其它大分子有機物,甚至可通過靶向特定的膜蛋白識別病毒、細菌和細胞。 目前,適配體已被廣泛用于靶向藥物遞送、生物分子識別和檢測[7]等領域,并已嘗試用于臨床治療方面。

適配體與靶標分子的親和力可達 mmol / L ~ pmol / L 級別,與抗體水平相當。 適配體具有抗體不能比擬的優(yōu)勢,如更高的選擇性和穩(wěn)定性、制備簡單、易修飾、無免疫原性等,因此受到研究者關注。

適配體的發(fā)展與篩選技術的進步密切相關。 研究者根據(jù) SELEX 的關鍵技術要點對傳統(tǒng)篩選技術進行了改良,如依據(jù)結合與未結合寡核苷酸的分離技術,提出了基于磁珠分離法的 SELEX 技術和基于毛細管電泳分離法的 SELEX 技術等;提出了基于不對稱 PCR 法、入核酸外切酶法和磁珠法的次級文庫制備技術。 但是,SELEX 技術仍存在篩選輪次多、篩選周期長、文庫合成量大、利用率低、樣品消耗量大等問題。 微流控芯片具有體積小、高通量和易集成等特點,基于微流控芯片的 SELEX 技術在一定程度上可解決上述問題,為實現(xiàn)適配體快速、高通量的體外篩選提供了新思路。本文依據(jù)近年來適配體篩選技術的研究進展,在總結 SELEX 及其關鍵技術要點的基礎之上,重點評述了基于微流控芯片和微陣列芯片 SELEX 技術的研究進展。

微流控芯片概念及特點

微流控芯片又稱為微全分析系統(tǒng),是由 Manz 等在 20 世紀 90 年代首次提出并發(fā)展起來的跨學科分析技術。 通過微加工技術,在硅、玻璃或有機聚合物基質上構建流體微通道、反應微腔室和儲液池等微結構單元,將分析過程的樣品制備、反應、分離、檢測等基本操作單元集成到一塊微米尺度的芯片上,自動完成分析全過程。 微流控芯片具有集成化、小型化、自動化等特點,以及樣品和試劑消耗量少、反應速度快、可大量平行處理等優(yōu)點,在生物、化學和醫(yī)學等領域表現(xiàn)出巨大的發(fā)展?jié)摿Α?目前,微流控芯片技術已被廣泛用于細胞培養(yǎng)、基因擴增與分析和蛋白質檢測等領域。

基于微流控芯片的 SELEX 技術是近年發(fā)展起來的一種快速高效的適配體篩選體系。 將微流控芯片與 SELEX 技術結合,可將樣品和試劑的消耗量降至微升級,大大降低了篩選成本, 提升了分析速度和準確性。 目前,已發(fā)展的微流控芯片 SELEX 技術主要包括磁珠法和溶膠-凝膠法等。

微流控芯片 SELEX 技術篩選適配體

基于磁珠的微流控 SELEX 技術 基于磁珠的微流控 SELEX 技術主要包括連續(xù)流磁激活分離芯片(Continuous-flow magnetic activated chip-based separation, CMACS) 系統(tǒng)和微磁分離(Micro magnetseparation, MMS)系統(tǒng)。

Soh 研究組 利用 CMACS 系統(tǒng),通過芯片連續(xù)流磁分離對重組 A 型肉毒桿菌神經(jīng)毒素輕鏈的適配體進行篩選(圖 1)。 首先,通過 PCR 擴增制備 DNA 文庫,并通過 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)介導法將靶標分子固定在磁珠上; 然后,將 DNA 文庫與固定有靶標分子的磁珠共同孵育,在CMACS 芯片上進行連續(xù)洗滌; 最后,用生物素化的反義引物進行 PCR 擴增,通過磁珠法制備次級文庫,并測定其親和力。

圖 1 基于連續(xù)連續(xù)流磁激活芯片(CMACS)系統(tǒng)的 SELEX 過程示意圖

然而,CMACS 系統(tǒng)使用過程會出現(xiàn)微氣泡導致的氣流扭曲,以及微通道阻塞導致的磁珠聚集等問題,影響適配體的純度和回收率。 在后續(xù)的研究中,Soh 研究組開發(fā)了 MMS 系統(tǒng)(圖 2),將鐵磁材料整合到微通道中,通過芯片中鎳材料和緩沖液間磁導率的相對差異,實現(xiàn)對通道內流體動力和磁致動力的精確控制,減少了磁珠和適配體候選物的損失,實現(xiàn)了較高的分子分配效率。

圖 2 基于微磁分離系統(tǒng)的 SELEX 過程示意圖

Huang 等在 MMS 芯片的基礎上,將反應池、分離通道和微加熱系統(tǒng)整合到一塊芯片上,成功篩選出 C 反應蛋白的適配體,與傳統(tǒng) SELEX 技術相比,基于微流控芯片的 SELEX 技術在單輪篩選時間和樣品消耗量上均大大降低。

Ahmad 等利用 MMS 芯片高效的捕獲能力和可高流速洗滌的特點,成功篩選出 3 種蛋白質的適配體:人血小板衍生生長因子 BB(Kd = 0. 028 nmol / L)、凝血酶(Kd = 0. 33 nmol / L)和載脂蛋白 E3(Kd =3. 1 nmol / L)。 通過低濃度蛋白篩選和高流速、長時間洗滌,降低了非特異性吸附和弱結合的情況,獲得了與文獻不同的人血小板衍生生長因子 BB 和凝血酶的適配體序列,而且親和力也有了較大程度的提升。研究人員還發(fā)現(xiàn)適配體的親和力受蛋白質帶電狀態(tài)的影響,由人血小板衍生生長因子 BB在不同 pH 條件下的篩選結果發(fā)現(xiàn),在酸性緩沖液中,其與適配體具有更高的親和力。

Stoltenburg 等使用常規(guī)磁珠 SELEX 技術經(jīng) 13 輪篩選得到鏈霉親和素的適配體,其解離常數(shù)約為 56 ~ 86 nmol / L。 而使用 MMS 系統(tǒng)經(jīng) 3 輪分離后即得到了解離常數(shù)在 25 ~ 65 nmol / L 之間的適配體。 由此可見,基于微流控芯片的微磁分離 SELEX 技術比常規(guī)的磁珠 SELEX 技術更高效。

基于溶膠-凝膠的微流控 SELEX 技術

溶膠-凝膠是用含高化學活性的化合物作為前體,在液相下均勻混合并進行水解、縮合等反應,形成穩(wěn)定的透明溶膠體系,經(jīng)過膠粒間緩慢聚合,形成三維空間網(wǎng)絡結構的凝膠。 凝膠經(jīng)過干燥、燒結、固化,制備出納米乃至亞納米結構的材料。通過溶膠-凝膠及其衍生物材料固定蛋白質,無需親和試劑標記,加入硅酸鹽可最大程度地保持蛋白質的生物活性,且可長期保存不失活。 此外,溶膠-凝膠材料價格相對便宜,與芯片底板材料性質相近,具有極好的相容性。 這些特點為溶膠-凝膠在微流控芯片上的應用和這一類型芯片的大規(guī)模生產(chǎn)奠定了基礎。

基于溶膠-凝膠的微流控 SELEX 技術中,靶標分子包裹于具有多孔納米結構的硅酸鹽水凝膠中,寡核苷酸進入納米孔與靶標分子結合。 因此,溶膠-凝膠顆粒的加工工藝極為關鍵。 首先,溶膠-凝膠基質中納米孔結構的尺寸必須與靶標分子匹配; 其次,溶膠-凝膠顆粒須在點樣后長時間穩(wěn)定存在,并且有足夠強的粘附力,以防洗滌過程中顆粒丟失; 最后,每個顆粒的形態(tài)與尺寸必須統(tǒng)一,這對采用計算機自動分析實驗結果至關重要。

Ahn 等在芯片上集成溶膠-凝膠腔室和微加熱器等結構單元,用于文庫的洗脫和篩選(圖 3)。 該芯片帶有一組鋁電極、5 個相連的六邊形腔室和聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane, PDMS)微通道,各腔室靶標分子競爭性結合寡核苷酸鏈。 每個腔室內單個溶膠-凝膠顆粒的體積約為 7 nL,每個顆?？扇菁{ 30 fmol 蛋白質。 將該技術用于酵母 TATA 結合蛋白和幾種同源蛋白質的適配體篩選,僅經(jīng)過 6 輪篩選, 得到了解離常數(shù)為 2. 7 nmol / L 的 TATA 結合蛋白的適配體。

圖 3 基于溶膠-凝膠的微流控芯片 SELEX 技術原理示意圖:(A) 溶膠-凝膠微流體裝置的尺寸;(B)SELEX-on-a-chip 設備的總體示意圖

小分子適配體的體外篩選工作極具挑戰(zhàn)性,一是因為小分子難以固定; 二是受小分子本身結合位點數(shù)的限制,篩選出的適配體與小分子的結合也會受到影響。 通過改變溶膠-凝膠顆粒孔徑的尺寸,可很好地實現(xiàn)小分子靶標的固定。 Bae 等加工了具有納米孔徑和微米通道的溶膠-凝膠顆粒,寡核苷酸可在微米通道內自由移動,但與小分子靶標相互作用后,被截留在溶膠-凝膠顆粒中。 通過基于溶膠-凝膠法的微流控 SELEX 技術,采用 7 輪篩選得到了黃嘌呤的適配體,解離常數(shù)為 4. 2 滋mol / L。

微流控芯片與 SELEX 技術結合,提高了適配體的篩選效率,降低了篩選成本。 但是,基于微流控芯片的適配體篩選技術在流體流動過程中常會產(chǎn)生氣泡,對靶標分子與適配體的識別,以及后續(xù)的PCR 擴增等均會產(chǎn)生影響。

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