隨著科技的發(fā)展，通過抽取少量血液來分析腫瘤信息的“液態(tài)活檢”已經(jīng)逐漸具有趕超和替代傳統(tǒng)活檢的趨勢。

液態(tài)活檢的來源包括CTC（循環(huán)腫瘤細胞）、ctDNA（循環(huán)腫瘤DNA）、microRNA（循環(huán)microRNA）、Exosome（外泌囊泡小體）等四種，前面兩種目前在業(yè)界相對熱門。本文將重點介紹液態(tài)活檢之CTC的捕獲與鑒定。

圖1.液態(tài)活檢

1.循環(huán)腫瘤細胞（CTC）--基于微流控的全自動化體外診斷儀器設(shè)備

循環(huán)腫瘤細胞（CTC）被定義為自發(fā)或因診療操作脫離實體瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶進入外周血循環(huán)的腫瘤細胞。目前CTC的應(yīng)用主要在以下幾個方面：

1)在常規(guī)手段無法對早期腫瘤進行判斷時進行輔助診斷。

2) 在療效評估方面，癌癥患者進行化療、靶向治療后進行CTC 檢測，若CTC 數(shù)量減少，提示治療方式可能有效。相比于現(xiàn)階段的檢查手段，CTC 檢測技術(shù)操作更方便，應(yīng)用更簡單，可以更及時地提示醫(yī)生該患者是否適合化療或靶向治療。

3) 在術(shù)后監(jiān)測方面，主要是由于活檢無法高頻次檢測，而目前CTC 檢測在術(shù)后監(jiān)測中應(yīng)用可能更方便，檢測頻次會更高。

圖2.CTC在癌癥治療中的應(yīng)用場景

2.循環(huán)腫瘤細胞（CTC）的特性

1.稀有性：每10mL血液中可能僅含有幾個到幾十個循環(huán)腫瘤細胞。

2.非典型性的細胞形態(tài)：一般比血液細胞，正常組織細胞體積大；細胞核大，不規(guī)則，細胞核質(zhì)比高；不易發(fā)生變形。

3.異質(zhì)性：細胞表面抗原標志物表達差異；攜帶不同的分子信息；轉(zhuǎn)移潛力差異。

4.不同形態(tài)和類別：CTC可以是間質(zhì)型、上皮型或者上皮間質(zhì)混合型，CTC也既可以是單個細胞的CTC也可以是成團的CTCs(CTM)。

圖3.CTC的分類

3.CTC的富集

人體循環(huán)系統(tǒng)中CTC的含量極低,腫瘤轉(zhuǎn)移患者每毫升全血中僅有1～10 個CTC，因此要實現(xiàn)CTC的檢測對其進行分選富集是一個必不可少的步驟。CTC分選富集效果的優(yōu)劣將會直接影響其后續(xù)的檢測(計數(shù)、基因擴增、基因測序等)效果,因此高純度、高靈敏性(不丟失CTC)、快速、高細胞活性的CTC分選富集是CTC臨床應(yīng)用的重點和難點。

圖4.CTC的檢測流程圖

CTC 的富集方法可以分為免疫親和富集法和物理特性富集法。免疫親和法主要是根據(jù)細胞表面表達的特異性的蛋白將CTC篩選出來，物理特性富集主要是根據(jù)CTC 的大小和密度等特性將這些細胞篩選出來。

圖5.CTC的富集方法

圖6.常用CTC富集技術(shù)比較

3.1免疫親和捕獲法

免疫捕獲法的原理是將特異性抗原包被在已有同源抗體的磁珠上制成免疫磁珠再與靶細胞上抗原結(jié)合成“靶細胞—抗原抗體—磁珠”復(fù)合物，在磁場作用下向一定方向移動，從而富集靶細胞。免疫捕獲法又分為陽性富集，陰性富集和流式細胞術(shù)三種方法。

3.1.1陽性富集

使用表面耦聯(lián)抗目的細胞抗體的磁珠，細胞與磁珠結(jié)合后直接在磁場中被分離出來。其中的典型代表是CellsearchTM系統(tǒng)，CTC芯片（CTCs-chip）和MACS?Cell Separation 磁性細胞分選系統(tǒng)。

原理：采用抗EpCAM結(jié)合免疫磁珠捕獲EpCAM陽性CTC。

優(yōu)點：捕獲的CTC純度較高；能夠捕獲到血液中上皮型、上皮間質(zhì)混合型的CTC。

缺點：無法捕獲到間質(zhì)型CTC（EpCAM陰性）。

圖7.陽性富集—CTCs-Chip

3.1.2陰性富集

用特異性抗體CD45，CD14 等與白細胞結(jié)合，從而去除全血中的白細胞。典型代表是Cyttel/Cytelligen檢測系統(tǒng)。

原理：利用CD45磁珠抗體吸附白細胞，在磁場作用下去除白細胞，CTC被富集沉淀。

優(yōu)點：可檢出EpCAM、CK陰性的間質(zhì)型CTC。

缺點：樣本處理步驟多，CTC易丟失。

圖8.陰性富集法—Cyttel

3.1.3流式細胞術(shù)

原理：根據(jù)白細胞表達CD45抗原、CK陽性CTCs表達EpCAM，采用不同熒光素標記的抗CD45和抗EpCAM，通過流式細胞術(shù)分析和分選CK陽性細胞的CTC。

優(yōu)點：可在檢測的同時進行細胞形態(tài)、DNA倍數(shù)分析。

缺點：敏感性較低，需要的血液樣本量大，缺乏規(guī)范的臨床操作方法。

3.2物理特性富集法

3.2.1濾膜法

濾膜法根據(jù)腫瘤細胞的體積大于白細胞體積分離CTC。其典型代表是濾膜濾法分離上皮源腫瘤細胞（ISET）。

原理：將全血經(jīng)過帶小孔8um的聚碳酸酯膜的過濾，即可除去白細胞富集得到CTC。

優(yōu)點：分離后細胞完整性好；可完全分離上皮型、間質(zhì)型CTC；可檢出循環(huán)腫瘤拴子。

缺點：不宜檢出細胞直徑小于8um的腫瘤如神經(jīng)內(nèi)分泌瘤。

3.2.2密度梯度離心

密度梯度離心法是根據(jù)腫瘤細胞與白細胞密度不同，通過梯度離心分離CTC。其典型代表是OncoQuick分離體系。

原理：在密度梯度離心后，白細胞通過多孔濾膜被濾除，而CTC被富集在介質(zhì)層中，洗脫后得到CTC。

優(yōu)點：可分離CK陽性和陰性細胞。

缺點：CTC遷移可能至血漿層、紅細胞層和粒細胞層而丟失；CTC微栓子可能沉入紅細胞層而丟失；與腫瘤細胞特性、離心時間和溫度等有關(guān)；用血量多，一般需要15-30ml血。

圖9.密度梯度離心法

4.CTC的分析與鑒定

利用免疫親和或物理特性法可富集到CTC，接下來還需要結(jié)合有效的下游分析方法。一方面，由于目前CTC捕獲技術(shù)不能保證百分之百的純度，需要對所得到的細胞進行鑒定，以進一步確定CTC細胞的數(shù)目，以減少CTC數(shù)目判定的假陽性率和假陰性率。另一方面，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，不僅CTC的數(shù)目在動態(tài)的變化，CTC所攜帶的分子標志物也在變化，通過對CTC表面標志物檢測，能夠反應(yīng)腫瘤發(fā)生發(fā)展的動態(tài)變化，是研究腫瘤發(fā)生發(fā)展機制的有效策略，并能很好地指導(dǎo)臨床治療。常用的CTC檢測技術(shù)如免疫熒光、PCR、FISH及高通量測序等。

1. 免疫熒光法（IF）: 實體腫瘤細胞一般均為上皮來源，細胞內(nèi)會表達角蛋(cytokeratin, CK)或其他腫瘤標示物(如HER2)。借助免疫熒光染色，可對來自實體瘤CTC中的瘤標進行識別，從而達到檢測CTC的目的。這也是目前檢測CTC的最常見方法。缺點是，在CTC形成過程的間質(zhì)化(EMT)階段，大量的CK會降解，從而在CTC檢測過程中出現(xiàn)假陰性。

2. 熒光原位雜交（FISH）: 熒光原位雜交，是根據(jù)已知細胞內(nèi)特異的DNA序列，以利用熒光標記的特異寡聚核苷酸片段作為探針，與細胞內(nèi)的基因組中DNA分子雜交，檢測該特異基因序列的存在與豐度。FISH技術(shù)與CTC結(jié)合，不僅可以檢測CTC表面標志物，也可以檢測CTC細胞內(nèi)部的標志物及核型等。

3. RT-PCR，反轉(zhuǎn)錄PCR: 提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用引物和逆轉(zhuǎn)錄酶將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。RT-PCR使RNA檢測的靈敏性提高了幾個數(shù)量級，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。結(jié)合RT-PCR可同時對若干個基因的表達進行檢測。位點特異性PCR技術(shù)可用于檢測CTC攜帶的驅(qū)動基因的突變情況。

二代測序 : CTC數(shù)量少，直接進行二代測序難度大。需要將單細胞的DNA擴增后，再利用二代測序檢查基因序列。但是，目前單細胞測序的技術(shù)僅僅停留在實驗室階段，未來向市場推廣還有很長的路要走。而且由于腫瘤細胞的異質(zhì)性，單細胞測序是否有代表性還需要更多的科學(xué)研究來證明。

圖10.CTC檢測技術(shù)比較

（文章來源:微信 體外診斷網(wǎng) 作者：湯明輝 轉(zhuǎn)載僅供參考學(xué)習(xí)及傳遞有用信息，版權(quán)歸原作者所有，如侵犯權(quán)益，請聯(lián)系刪除）

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