作為一切分子生物學研究的基礎，核酸的提取永遠是開展一項研究的第一步，提取核酸的質量高低是下游分子生物學實驗成敗的關鍵。本文將會詳細介紹關于DNA提取的相關信息，包括DNA提取的原理、提取過程的注意事項、不同類型樣品DNA的提取推薦方法等等。

DNA提取的基本原理

DNA的提取可以簡單的分為裂解和純化兩大步驟，裂解是破壞樣品細胞結構，從而使樣品中的DNA游離在裂解體系中的過程，純化則是使DNA與裂解體系中的其它成分，如蛋白質、鹽及其它雜質徹底分離的過程。

裂解過程

常規(guī)的裂解液都含有去污劑 (如SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20等) 和鹽 (如Tris、EDTA、NaCl等)。

· 去污劑的作用

· 使蛋白質變性；

· 破壞膜結構；

· 去除與核酸相互作用的蛋白質。

· 鹽的作用

· 提供合適的裂解環(huán)境，如Tris;

· 抑制核酸酶對核酸的降解，如EDTA；

· 維持核酸結構穩(wěn)定，如NaCl。

裂解體系中還可能加入蛋白酶，利用蛋白酶將蛋白質消化成小的片段，促進DNA與蛋白質的分離，同時，也便于后續(xù)的純化操作。

純化過程

酚氯仿抽提

該方法包括兩個步驟：

00001. 利用酚氯仿對裂解體系進行反復抽提以去除蛋白質，實現(xiàn)DNA與蛋白質的分離；

00002. 再用醇將DNA沉淀下來，實現(xiàn)核酸與鹽的分離。

酚氯仿抽提是去除蛋白質的有效手段，但如果蛋白質含量超過了其飽和度，裂解體系中的蛋白質就不會被一次性去除，需要進行多次反復抽提，而每次的抽提均會導致核酸的損失。

酚氯仿抽提最大的優(yōu)勢是成本低廉，對實驗條件要求較低。

高鹽沉淀法

高鹽沉淀法是酚氯仿抽提方法的一個變種，其省略了酚氯仿抽提操作的麻煩，并且幾乎克服了酚氯仿抽提方法的一切缺點，只是得到DNA的純度不夠穩(wěn)定。

離心柱純化

該方法利用某些固相介質，在某些特定的條件下，選擇性地吸附核酸而不吸附蛋白質及鹽的特點，實現(xiàn)核酸與蛋白質及鹽的分離，是目前試劑盒提取廣泛使用的方法。

該方法受人為操作因素影響小，提取DNA的純度穩(wěn)定性很高，其缺點是當樣品過量時，需要反復進行離心，對樣品的提取效率較低。

磁珠法

該方法將純化介質包被在納米級的磁珠表面，通過介質對DNA的吸附，在外加磁場的作用下使DNA附著于磁珠并定向移動，從而達到核酸與其它物質分離的目的。

與其它集中方法相比，磁珠法具有無可比擬的優(yōu)勢，包括：

· 提取靈敏度高 (只需微量的樣本)；

· 純化的純度高 (能夠使核酸完全與雜質分離)；

· 提取產(chǎn)量高 (每mg磁珠能吸附500μg DNA)；

· 分離速度快 (磁場分離只需幾秒鐘)；

· 自動化操作 (通過機器自動完成操作過程，無需人力)；

· 高通量提取 (可同時完成數(shù)百個樣品的提取)；

· 無毒無害無污染 (試劑中不含任何有毒物質)。

該方法依賴于磁力分離裝置或自動提取儀，目前價格依然很高，并不適用于小型實驗室常規(guī)實驗。

DNA提取的注意事項

樣品的采集和保存

樣品的采集和保存是DNA提取的第一步，合適的樣品采集和保存方法對于DNA提取的成敗至關重要，尤其是有些珍貴樣品，其采集和保存的方式更是需要特別關注。

動植物樣品的采集

· 動物的內(nèi)臟和皮膚樣品要在動物死亡后2h以內(nèi)采集，通常采集多個重復，切成小塊保存在消毒后的離心管中；

· 動物呼吸道樣品通過棉拭子進行蘸取，完成采樣后立即置于5mL磷酸鹽緩沖液中；

· 動物血液樣品采集后，立即加入抗凝劑，封口病豎立插入樣品盒，盡量不要使用肝素抗凝；

· 植物樣品采集時優(yōu)先選取核酸含量較多的部位，如植物的幼嫩部位；

· 采集植物樣品時建議使用無菌水或75%乙醇擦拭或沖洗干凈，再用吸水紙吸干樣品表面液體。

微生物相關樣品采集

針對微生物研究相關的樣品，首先要避免人源污染，采樣的器具都應經(jīng)過高溫滅菌，采樣過程中要戴手套。

其次要關注樣品運輸和處理的速度，很多環(huán)境微生物研究的樣品并非來自實驗室，而是來源于自然環(huán)境，有些樣品的采集位點甚至在人跡罕至的地區(qū)，這就涉及到樣品的運輸問題。最理想的樣品運輸條件是在液氮中冷凍運輸，如沒有條件也可將樣品裝入含有冰袋的泡沫箱中運輸，如樣品運輸距離較遠、時間較長，最好選擇專業(yè)的冷鏈運輸公司。

針對水體樣品微生物群落的研究，需要用抽濾的方式將樣品中的微生物濃縮至濾膜上，之后再提取其DNA，通常情況下普遍認為采用0.22μm孔徑的濾膜進行抽濾能夠收集到水體樣品中的完整微生物群落。

有時我們會首先使用0.8μm孔徑的濾膜對水體樣品進行預處理，以去除大的顆粒物質，之后再用0.22μm濾膜收集微生物，這時會遇到一個問題，就是去除的顆粒物質也會吸附一部分微生物，因此造成了最終收集的微生物樣品不完整，本人之前的一篇文章就被審稿問了這個問題，所以在進行樣品處理的時候，一定要首先明確要研究的是被顆粒物吸附的微生物、還是游離態(tài)的微生物、或者是完整的微生物群落，以確定最適合的抽濾方案。

樣品的保存

絕大部分情況下，使用新鮮樣品可以獲得最好的結果。如果組織樣品不能馬上進行DNA提取，短期內(nèi)可以冷凍于-20℃，稍長時間的保存可以采用無水乙醇進行固定。

此外還推薦另外一個可以長期保存的方法 (適用于有錢人)，可以使用QIAGEN公司的RNAlater進行組織樣品的保存，這個試劑不僅可以保存RNA，同時也能夠防止DNA的降解，本人之前有過保存了一年左右的樣品，DNA提取的效果同樣很好。

DNA提取方法的選擇

開展針對某個實驗樣品的DNA提取之前，一定要先行收集該樣品的特性信息，例如該樣品的核酸含量、酶含量、特殊雜質含量等，否則就會造成DNA提取失敗，從而無法開展后續(xù)實驗。只有對實驗樣品有所了解，才能正確選擇DNA提取方法。

含蛋白酶的裂解方法，可以認為是抽提基因組 DNA 的首選。蛋白酶的作用是分解蛋白質，從而使蛋白質變小，促進蛋白質的游離，基因組DNA是很容易“纏”住其它生物大分子物質，蛋白質被蛋白酶消化變小后，不容易被基因組DNA“纏”住，有利于蛋白質在純化過程中被去除，使最終獲得的基因組DNA的純度更高。

含CTAB的裂解液，是針對富含多糖樣品 (如細菌、植物等) 基因組DNA抽提的首選裂解方法。CTAB的質量對裂解效率有很大的影響，盡量使用高純度的CTAB，并且不要輕易更換生產(chǎn)廠家。CTAB的少量殘留也會對酶活性有巨大影響，所以洗滌是否徹底也是該方法成功與否的關鍵。裂解時的溫度，一般使用65℃，但如果發(fā)現(xiàn)DNA降解嚴重或者得率太低，可以嘗試在37～45℃進行裂解。

當對大量純培養(yǎng)細菌進行PCR鑒定時，可以直接使用未裂解的菌體當作模版進行PCR，只需延長PCR預變性的時間，即可在該階段完成菌體的裂解并釋放DNA。但是該方法由于沒有經(jīng)過純化的過程，因此可能出現(xiàn)一定的假陽性，該方法最適合從大量菌株樣本中篩選含有特定基因的目的菌株，但是并不適合判斷某一特定菌株是否含有目的核酸片段。

DNA的保存

提取得到的DNA通常使用TE buffer進行最后的溶解，其含有的EDTA可以減少DNA被可能殘留的DNase降解的風險，但是如果提取方法合適、操作得當，則幾乎不會殘留DNase，使用無菌水溶解DNA也是可以的。

提取到的DNA一般情況下在-20℃保存是沒有問題的，但是要避免反復凍融，因此，最好在提取完成之后按照后續(xù)實驗所需進行分裝，這樣每次使用一個分裝好的DNA，避免反復凍融造成的DNA降解。如果提取的DNA需要長期保存 (一年以上)，最好保存于-80℃。

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