微流體設(shè)備有望簡化遺傳疾病的診斷

在Dino Di Carlo位于加州大學(xué)洛杉磯分校的實(shí)驗(yàn)室，生物工程師們一天中有許多時(shí)間都從頭到腳包裹得嚴(yán)嚴(yán)實(shí)實(shí)，而且看起來臉色蠟黃。這些工程師在潔凈室工作，在那里，經(jīng)過過濾的穩(wěn)定氣流會(huì)去除空氣中的顆粒物。藍(lán)光或紫光會(huì)導(dǎo)致他們使用的光敏材料固化，所以只能使用奶黃色的燈光。

他們與該領(lǐng)域的其他科學(xué)家正在制造用于預(yù)處理和分析血液和其他流體樣本，以診斷基因突變（比如癌細(xì)胞攜帶的突變）的工具。此類工具一般不需要用到潔凈室，但Di Carlo實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的工具依賴于流體沿管道流動(dòng)的能力，這些管道小到可能會(huì)被一顆灰塵堵?。哼@一領(lǐng)域被稱作微流體技術(shù)。理論上，這些在載玻片大小的芯片上開展的分析應(yīng)該是快速而自動(dòng)化的：輸入樣品，讀出結(jié)果，簡單得連新手都可以使用。但在實(shí)際中，這些設(shè)備很少能做到全自動(dòng)運(yùn)行，通常都需要一些樣品預(yù)處理過程。

包括Di Carlo在內(nèi)的科研人員正在著手解決這些缺點(diǎn)，試驗(yàn)各種材料和設(shè)計(jì)，好讓芯片更易制作。他們面臨的挑戰(zhàn)包括預(yù)測狹小空間內(nèi)的流體行為，以及制作出高效廉價(jià)的芯片等。日本沖繩科學(xué)技術(shù)大學(xué)院大學(xué)的化學(xué)工程師Amy Shen指出，解決這些問題需要多學(xué)科合作。帶來的回報(bào)則包括節(jié)省實(shí)驗(yàn)室時(shí)間和經(jīng)費(fèi)、開發(fā)加速遺傳病和傳染病診斷的醫(yī)療儀器等等。

通過微流體系統(tǒng)，科學(xué)家得以對(duì)珍貴或數(shù)量有限的樣品加以利用，在使用昂貴試劑時(shí)獲得更多的結(jié)果。對(duì)體積微小的液體進(jìn)行操作使得快速并行分析成為了可能。由于只有機(jī)器才能操縱這么微小的體積，微流體系統(tǒng)也有利于自動(dòng)化實(shí)驗(yàn)流程，從而減少了人為操作失誤。理想情況下，就連只受過極少訓(xùn)練的技術(shù)人員也能開展試驗(yàn)。

這一目標(biāo)仍然難以實(shí)現(xiàn)。目前，開發(fā)人員重點(diǎn)關(guān)注的是將分析血液和其他體液中DNA或RNA的過程微型化，比如開發(fā)微小版的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀來復(fù)制和量化稀有的基因序列，或通過雜交來連接核酸與熒光探針。其結(jié)果是，微芯片方法往往需要使用已經(jīng)經(jīng)過處理的生物材料：舉例來說，需要先去除會(huì)干擾反應(yīng)的組分。位于法國巴黎的基礎(chǔ)科學(xué)研究機(jī)構(gòu)，法國國家科學(xué)研究中心（CNRS）的研究主管Jean-Louis Viovy表示，主要瓶頸在于“試圖擴(kuò)大微流體領(lǐng)域的工具箱，從而把從實(shí)際樣本到獲得結(jié)果過程中的各個(gè)步驟都集成在微流體系統(tǒng)中?！?Viovy也是巴黎附近的微流體公司Fluigent的技術(shù)創(chuàng)始人。

清除疾病

Di Carlo的實(shí)驗(yàn)室為一種特殊的樣本處理過程開發(fā)了方法：分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）。CTCs是一種血液腫瘤標(biāo)志物，能揭示出腫瘤起源和引起腫瘤的突變。實(shí)驗(yàn)室使用了常用的光刻技術(shù)，以透明硅橡膠材料PDMS為原材料制作芯片。在潔凈室，工程師將光刻膠鋪在圓形硅片（即制作計(jì)算機(jī)微芯片的材料）上。 然后，工程師模仿半導(dǎo)體業(yè)的流程，將打印出來的黑色“光掩?！保ㄉ嫌行酒璧墓艿佬螤睿艿啦糠滞腹猓└采w在光刻膠上，再將其在紫外光下曝光，使透光部分的光刻膠固化，從而產(chǎn)生與芯片管道結(jié)構(gòu)相反的模具。

然后，Di Carlo的工程師回到普通實(shí)驗(yàn)室，為了制作芯片，他們將液態(tài)的PDMS倒在先前做好的具有管道結(jié)構(gòu)的硅片上，并在65攝氏度下烘干，以固化PDMS。 最后，他們將一個(gè)載玻片與PDMS的底部粘合在一起，就制成了一個(gè)原型芯片；它看起來和摸起來都像是一種特別結(jié)實(shí)的透明膠狀物。整個(gè)過程大概需要一天。

Di Carlo說，一旦他們選定了一種能夠滿足他們目標(biāo)的設(shè)計(jì)，他們就會(huì)訂制塑料版本的芯片。塑料芯片的制作過程與塑料玩具一樣。

大多數(shù)芯片制作技術(shù)產(chǎn)出的都是二維結(jié)構(gòu)，但三維結(jié)構(gòu)有時(shí)也很有價(jià)值。在Di Carlo正在設(shè)計(jì)的一種芯片中，他使用磁場將液體從一個(gè)狹窄的管道拉到一個(gè)更高、更寬的管道。隨著液體開始在較大的腔體中鋪展，表面張力會(huì)使它形成球體，進(jìn)而變成液滴。Di Carlo說：“它基本上是一種納升級(jí)的移液器，這種操作是人手工無法實(shí)現(xiàn)的?！?芯片能通過這種分割方法將血液等流體分成多個(gè)離散的反應(yīng)小室，從而同時(shí)進(jìn)行多個(gè)實(shí)驗(yàn)。

Box1：芯片設(shè)計(jì)技巧

微流體渦旋芯片中形成的層流微旋渦上的微珠軌道。

制作微流控芯片的過程一般始于用AutoCAD, Adobe Illustrator或SolidWorks等軟件繪圖。加州大學(xué)洛杉磯分校的生物工程師Dino Di Carlo說：“我們可以畫出管道的路徑?！?/span>

他說，微管道中的流體流動(dòng)是可以預(yù)測的。但是，處理數(shù)據(jù)需要用到超級(jí)計(jì)算機(jī)。盡管軟件有所幫助，大多數(shù)研究人員還是更愿意反復(fù)制作芯片，直到獲得他們想要的流動(dòng)為止。Fluigent微流體公司的技術(shù)創(chuàng)始人Jean-Louis Viovy表示，F(xiàn)luigent公司提供的軟件工具能幫助科研人員改進(jìn)芯片設(shè)計(jì)。

Di Carlo課題組開發(fā)了他們自己的仿真軟件 ，名叫uFlow。他們認(rèn)識(shí)到，微流控芯片經(jīng)常包含重復(fù)的結(jié)構(gòu)元素，例如分開液流的S形曲線或微柱，他們用超級(jí)計(jì)算機(jī)計(jì)算了每一個(gè)元素，以弄清它們?nèi)绾胃淖兞鲃?dòng)。uFlow使用了這些數(shù)據(jù)，將每個(gè)元素的終點(diǎn)作為下一個(gè)的起點(diǎn)，從而在模擬復(fù)雜管道形狀時(shí)節(jié)約處理能力。

一旦得到了想要的芯片設(shè)計(jì)，科研人員便可以從幾種獲得芯片的方法中做出選擇。他們可以自己設(shè)計(jì)制作，也可以訂購定制芯片。就職于麻省總醫(yī)院的研究者 Shannon Stott和她的同事向日本電子巨頭索尼公司的一個(gè)分部（目前由德國Stratec公司所有）外包了制作過程，用索尼制作藍(lán)光光盤的機(jī)器來制作血液分選芯片。

還有一些標(biāo)準(zhǔn)微流控芯片可用于實(shí)現(xiàn)常用功能。供應(yīng)商有很多：比較主流的選擇包括位于美國加州圣克拉拉的安捷倫科技公司； 位于英國羅伊斯頓的Dolomite公司；位于加州南舊金山的Fluidigm公司和前文所述的Fluigent公司。 

要制作三維芯片，科學(xué)家們通常需要將聚合物層層堆疊在光刻模具中。然而，一種入門級(jí)芯片制作方法的設(shè)計(jì)者表示，3D打印正在改變這一狀況，因?yàn)樗恍枰鄬I(yè)知識(shí)或設(shè)備。荷蘭瓦赫寧根大學(xué)的化學(xué)家Vittorio Saggiomo在家中偶然萌生了這個(gè)想法。他 會(huì)3D打印塑料工具（比如小燈或者移液器支架）和有趣的東西（比如鳥窩）。有一天，他把一個(gè)3D打印的《星球大戰(zhàn)》頭盔浸入了丙酮溶液中，好讓頭盔表面更加光滑，但他放的時(shí)間太長，整個(gè)頭盔都被溶解了。他意識(shí)到，同樣的方法也可以用來塑造微管道。

Saggiomo和他同為化學(xué)家的同事Aldrik Velders將這個(gè)過程應(yīng)用在了實(shí)驗(yàn)室里。他們使用3D打印機(jī)制作出想要的管道形狀，讓塑料結(jié)構(gòu)懸浮在PDMS。待固化后，再將其在丙酮中浸泡過夜以溶解塑料，最終得到立等可取的微芯片。Saggiomo和Velders正在使用這種方法制作螺旋管和交織的管道。其他方法很難制作這類結(jié)構(gòu)：舉例來說，他們?cè)O(shè)計(jì)的一種芯片擁有一根被螺旋管道纏繞的直管道。Saggiomo說，使用者可以在螺旋管道里通熱液或冷液，從而在PCR等技術(shù)中改變樣品的溫度。即使在標(biāo)準(zhǔn)制造流程中，芯片設(shè)計(jì)師也能使用諸如V型、角和蜿蜒曲線等管道設(shè)計(jì)來發(fā)揮創(chuàng)意。Di Carlo說，雖然這一領(lǐng)域已經(jīng)開始了標(biāo)準(zhǔn)化設(shè)計(jì)的開發(fā)，但在設(shè)計(jì)多樣的流體通路方面仍有許多發(fā)揮的空間。

芯片設(shè)計(jì)師也在努力預(yù)測這一量級(jí)上的流體動(dòng)力學(xué)。Elvesys創(chuàng)新中心（位于巴黎的一個(gè)微流體公司）的工程師Walter Minnella表示：“這個(gè)尺度下，（流體）的物理機(jī)制與浴缸里的水完全不同?！币恍┝?，比如重力，變得可以忽略不計(jì)，而高表面積/體積比會(huì)產(chǎn)生表面張力，并對(duì)流體和管道壁面之間的相互作用產(chǎn)生極大的影響。Di Carlo說，水溶液會(huì)變得粘稠，就像蜂蜜，但沒有湍流。 因此，流體運(yùn)動(dòng)是可以預(yù)測的——但他估計(jì)可能仍然需要超級(jí)計(jì)算機(jī)算上一兩天才能解決，這就導(dǎo)致反復(fù)模擬變得不那么現(xiàn)實(shí)。大多數(shù)科學(xué)家選擇了經(jīng)驗(yàn)方法：構(gòu)建，測試，再重復(fù)（參見“芯片設(shè)計(jì)技巧”）。

血液中細(xì)胞的分離

在定下目前的芯片設(shè)計(jì)前，麻省總醫(yī)院的機(jī)械工程師Shannon Stott和她的課題組制作了多個(gè)版本的芯片。他們研究的是液體活檢，一種根據(jù)血液中的遺傳線索檢測和診斷疾病的方法。他們的目標(biāo)是開發(fā)一個(gè)可以從微創(chuàng)采集的血液樣本中分離和分析CTCs的系統(tǒng)。他們將芯片命名為CTC-iChip — 'i'代表“慣性聚焦”（inertial focusing'），研究者利用這種技術(shù)將細(xì)胞排成一行，從而把CTCs與其他血細(xì)胞分開（參見“芯片結(jié)構(gòu)解析”部分）。除此之外，團(tuán)隊(duì)還能利用這種芯片計(jì)數(shù)患者血液樣本中的CTCs，并研究其遺傳組成。

CTC-iChip由塑料制成，將三個(gè)階段整合到了一塊芯片中。在第一階段，芯片會(huì)去除掉不需要的血液成分。科學(xué)家用磁珠標(biāo)記白細(xì)胞，然后讓液體流過配有一系列塑料微柱的腔室。紅細(xì)胞和蛋白質(zhì)等尺寸較小的成分能穿過這些微柱，就像蛾子飛過茂密的森林一樣，而大一些的細(xì)胞，比如白細(xì)胞和稀有的CTCs則更像笨拙的大熊。它們被微柱彈離后，個(gè)大的細(xì)胞會(huì)沿著漏斗狀流道進(jìn)入第二階段，即S型曲線流道，Stott將它們稱為“搖擺器”，其作用是將細(xì)胞排成一行。在第三階段，芯片用磁鐵吸引連接了磁珠的白細(xì)胞離開流線，從而留下CTCs。

Di Carlo的實(shí)驗(yàn)室則開發(fā)了自己的微流體方法，以分類血樣成分。他們使用了配有一系列側(cè)室的管道，形狀如同教堂外部的十字形側(cè)翼走廊。他之前的學(xué)生SJ Claire Hur（現(xiàn)在是約翰·霍普金斯大學(xué)的機(jī)械工程師）注意到，較大的細(xì)胞會(huì)被捕獲在微流體通道拓寬形成的旋渦中，就像樹葉和垃圾圍繞河流拐彎處或河流中的巖石聚積一樣。他的團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一個(gè)系統(tǒng)，利用這一原理分離CTCs用于后續(xù)分析，該系統(tǒng)現(xiàn)在已由加州門洛帕克市的Vortex Biosciences公司批量生產(chǎn)。研究人員正在臨床研究中使用Vortex公司的產(chǎn)品，以識(shí)別CTCs中的標(biāo)記物。這些標(biāo)記物或許能揭示出腫瘤對(duì)特異性免疫療法的響應(yīng)程度。

Vortex的微芯片本身只有手掌大小，但整個(gè)系統(tǒng)還包括用于加入樣品的外部管道和泵，以及回收收集到的CTCs的組分收集器。整個(gè)設(shè)備比微波爐稍大一點(diǎn)，不太像許多科學(xué)家所希望的一體化“芯片實(shí)驗(yàn)室”，而更像一個(gè)“實(shí)驗(yàn)室中的芯片”。

Di Carlo表示，這種“實(shí)驗(yàn)室中的芯片” 通常就已經(jīng)夠用了，它們?nèi)匀槐瘸Ｒ?guī)方法更節(jié)約經(jīng)費(fèi)，還能盡可能減少實(shí)驗(yàn)者的人為誤差，從而改進(jìn)結(jié)果。 但是，一個(gè)真正的芯片實(shí)驗(yàn)室設(shè)備將有能力在發(fā)展中國家的診所或野外工作站開展快速基因檢測。在這些地區(qū)，購買和使用PCR儀或離心機(jī)來分離血樣可能是不現(xiàn)實(shí)的。

真正的芯片實(shí)驗(yàn)室還在路上

工程師已經(jīng)想出了一系列可能的解決方案。舉例來說，一些人正在開發(fā)廉價(jià)的紙芯片，用于擴(kuò)增和檢測血樣中傳染性微生物的基因。德國內(nèi)恩的Hain Lifescience公司設(shè)計(jì)了可以檢測特定DNA序列的測試條。一種芯片可以通過搜索APOE基因突變來確定一個(gè)人患阿爾茨海默病的風(fēng)險(xiǎn)，另一種則能報(bào)告與強(qiáng)直性脊柱炎（一種侵犯脊柱的關(guān)節(jié)炎）相關(guān)的基因。

密歇根州立大學(xué)的環(huán)境工程師Syed Hashsham正在開發(fā)一種基于芯片的設(shè)備，以應(yīng)用于癌癥和傳染病領(lǐng)域的基因診斷。他表示：“我們必須簡化一切?！睘榱私档彤a(chǎn)品成本，并且讓野外科學(xué)家也能密封芯片，他放棄了在野外條件下難以封裝的硅基芯片，而選用了使用激光切割、薄膜封裝的塑料芯片。另一個(gè)挑戰(zhàn)是如何在野外現(xiàn)場環(huán)境中擴(kuò)增出稀少的遺傳物質(zhì)，以達(dá)到能夠檢出的量。標(biāo)準(zhǔn)方法，也就是PCR，需要反復(fù)加熱和冷卻樣品到精確的溫度。但設(shè)計(jì)出一種便攜、便宜、能夠在不同溫度間切換的小型設(shè)備并非易事，Hashsham說：“在野外，熱循環(huán)是行不通的?！?/span>

在他的手持式微流體設(shè)備“Gene-Z”中，他采用了另一種核酸擴(kuò)增技術(shù)來識(shí)別和定量已知的基因序列，比如指示癌癥的小分子核糖核酸（miRNA），或者傳染性有機(jī)體的基因。該技術(shù)被稱為環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)，使用的是與PCR反應(yīng)不同的酶，而且不需要溫度循環(huán)。研究人員將體液樣本（如唾液）與熒光染料混合，熒光染料會(huì)與反應(yīng)中產(chǎn)生的任意DNA結(jié)合，然后用注射器將混合物推入管道，管道連接著16個(gè)預(yù)先加入DNA擴(kuò)增試劑、并晾干備好的獨(dú)立儲(chǔ)液池。反應(yīng)完成后，該設(shè)備會(huì)通過使用發(fā)光二極管和傳感器來檢測熒光，以指示陽性反應(yīng)。

Hashsham說，整個(gè)設(shè)備可由iPod Touch控制，而且制作成本不超過200美元。每個(gè)一次性芯片包括64個(gè)儲(chǔ)液池，總共可以測試四個(gè)樣品，成本低于一美元。他已經(jīng)驗(yàn)證了Gene-Z對(duì)100多種疾病的檢測結(jié)果。他表示，現(xiàn)在的挑戰(zhàn)在于說服投資人出資生產(chǎn)無法馬上獲利的設(shè)備，因?yàn)樗Ｍ麑⑦@一設(shè)備應(yīng)用能通過快速診斷改變醫(yī)療過程、挽救生命的地區(qū)，比如非洲。

將科研想法轉(zhuǎn)化到商業(yè)世界確實(shí)很難——Shen也同意這種觀點(diǎn)。她還指出，公司或許不會(huì)投資太過昂貴，或者無法用現(xiàn)有的流水線生產(chǎn)的設(shè)計(jì)。這意味著，微流體系統(tǒng)距離芯片實(shí)驗(yàn)室的理念還有很長的路要走。她說：“差距仍然存在，但我認(rèn)為我們正在慢慢縮小這一差距。我們終將實(shí)現(xiàn)真正意義上的芯片實(shí)驗(yàn)室?！?/span>?

Nature|doi:10.1038/545511a

文獻(xiàn)來源：發(fā)布在2017年5月24日的《自然》科技專題上 原文作者：Amber Dance（轉(zhuǎn)載僅供參考學(xué)習(xí)及傳遞有用信息，版權(quán)歸原作者所有，如侵犯權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)系刪除）