體內(nèi)組織細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，所需培養(yǎng)環(huán)境基本相似，但由于物種、個(gè)體遺傳背 景及所處發(fā)育階段等的不同，各自要求條件有一定差別，所采取的培養(yǎng)技術(shù)措施 亦不盡相同，現(xiàn)介紹個(gè)別組織細(xì)胞培養(yǎng)的要點(diǎn)如下:

第一節(jié) 上皮細(xì)胞培養(yǎng)

上皮細(xì)胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分，又由于癌起源于 上皮組織，故上皮細(xì)胞培養(yǎng)特別受到重視。但上皮細(xì)胞培養(yǎng)中常混雜有成纖維細(xì) 胞，培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)速度往往超過(guò)上皮細(xì)胞，并難以純化，同時(shí)上皮細(xì)胞難以在體外 長(zhǎng)期生存，因此純化和延長(zhǎng)生存時(shí)間是培養(yǎng)關(guān)鍵。 體內(nèi)上皮細(xì)胞生長(zhǎng)在膠原構(gòu)成的基膜， 因此培養(yǎng)在有膠原的底物上可能利于生長(zhǎng)， 另外人或小鼠表皮細(xì)胞培養(yǎng)在以 3T3 細(xì)胞為飼養(yǎng)層（用射線照射后）時(shí)，細(xì)胞易 生長(zhǎng)并可發(fā)生一定程度的分化現(xiàn)象。降低 PH、Ca2+含量和溫度，向培養(yǎng)基中加 入表皮生長(zhǎng)因子，均有利于表皮細(xì)胞生長(zhǎng)。 以表皮細(xì)胞為例， 用皮膚表皮和真皮分離培養(yǎng)法可獲得純上皮細(xì)胞， 其法如下 （黑 木凳志夫 1981） 

1、 取材： 外科植皮或手術(shù)殘余皮膚小塊， 早產(chǎn)流產(chǎn)兒皮膚更好， 取角化層薄者， 切成 0.5－1 平方厘米小塊。 

2、置 0.02%EDTA 中，室溫，5 分鐘。 

3、換入 0.25%胰蛋白酶中，4℃過(guò)夜。 

4、分離：取出皮塊，用血管鉗或鑷子將表皮與真皮層分開。 

5、取出表皮，剪成更小的塊后，置 0.25%胰酶中，37℃，30—60 分鐘。 

6、反復(fù)吹打，制成懸液。 

7、培養(yǎng)：用 80 目不銹鋼紗網(wǎng)濾過(guò)后，低速離心，吸去上清。 

8、直接加入培養(yǎng)基（Eagle 加 20%小牛血清）制成細(xì)胞懸液，接種入培養(yǎng)瓶，CO2 溫箱培養(yǎng)。

第二節(jié) 內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)

內(nèi)皮細(xì)胞易于從大血管分離培養(yǎng)成單層細(xì)胞，對(duì)于研究?jī)?nèi)皮細(xì)胞再生、腫瘤促血 管生長(zhǎng)因子（TAF）等有很大價(jià)值。 研究人內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)以人臍帶靜脈灌流消化法最為簡(jiǎn)便，其法如下： 

1、產(chǎn)后新鮮臍帶，無(wú)菌剪取 10—15 厘米長(zhǎng)一段，如不能立即培養(yǎng)，可于 12 小 時(shí)內(nèi)保存于 4℃。 

2、用三通注射器吸取溫 PBS 液注入臍靜脈中洗去殘血，在入口處用線繩扎緊， 以防液體返流。 

3、用血管鉗夾緊臍帶一端，從另一端向臍靜脈中徐徐注入終濃度為 0.1%的粗制 膠原酶，充滿血管，消化 3—10 分鐘；注入口用線繩扎，以防液體返流。 

4、吸出含有內(nèi)皮細(xì)胞的消化液，于離心管中，注入溫 PBS 輕輕反復(fù)沖洗后，一 并注入離心管中（此步驟可重復(fù)） 。

5、離心去上清，加入 RPMI1640 培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，接種入培養(yǎng)器皿中，置溫 箱培養(yǎng)。兩至三天可見細(xì)胞長(zhǎng)成單層。

第三節(jié) 神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)

神經(jīng)細(xì)胞（神經(jīng)元）不易培養(yǎng)，只有在適宜情況下，如接種在膠原底層上，或加 入神經(jīng)生長(zhǎng)因子和膠質(zhì)細(xì)胞因子時(shí)，可出現(xiàn)一定程度的分化，長(zhǎng)出突起等現(xiàn)象， 但很難使之增值。而神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)組織中比較容易培養(yǎng)的成分。 人、鼠等腦組織即可用于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)，不僅能獲得生長(zhǎng)的膠質(zhì)細(xì)胞，也可 形成能傳代的二倍體細(xì)胞系。一般說(shuō)來(lái)，膠質(zhì)細(xì)胞在培養(yǎng)中生長(zhǎng)不穩(wěn)定，不易自 發(fā)轉(zhuǎn)化， 但對(duì)外界因素仍保持很好的敏感性， 可用 ROUS 病毒和 SV4 等誘發(fā)轉(zhuǎn)化。 設(shè)備： 無(wú)菌操作設(shè)備。 

一、設(shè)備 培養(yǎng)箱：恒溫 5%、10%CO2 維持培養(yǎng)液中 pH 值。 

二、大型設(shè)備 CO2 培養(yǎng)箱 倒置顯微鏡：用于每天觀察貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)情況。 解剖顯微鏡，用于準(zhǔn)確地取材。 常溫冰箱：-4℃，用于保存各種培養(yǎng)液，解剖液和鼠尾膠。 低溫冰箱：-20℃--80℃，用于儲(chǔ)存血清酶，貴重物品和試劑。 電熱干烤箱：用于消毒玻璃器皿。 高壓消毒鍋：用于消毒培養(yǎng)皿，手術(shù)器械。 過(guò)濾器：配制解剖液、培養(yǎng)液，必須過(guò)濾后才可使用，以去除細(xì)菌。 滲透壓儀，pH 劑，天平等。 

三、培養(yǎng)器皿及手術(shù)器械 1、培養(yǎng)皿：常用 35mm 塑料及玻璃皿，解剖取材用 15mm-90mm 直徑。 2、培養(yǎng)板，24-40 孔，可用于開放培養(yǎng)。 3、培養(yǎng)瓶： 4、吸管，常用 1，5，10ml，均需泡酸、洗滌、滅菌后方可使用。 5、各類培養(yǎng)液貯存器。 6、小型手術(shù)器械。 

準(zhǔn)備： 

一、配制培養(yǎng)液 解剖液： （1）解剖液：以無(wú)機(jī)鹽（去除 Ca2+ , Mg2+）加葡萄糖配制成 PBS 緩沖液，保 持一定的滲透壓和 pH 值。 基礎(chǔ)培養(yǎng)基（MEM） ：主要為多種氨基酸，加入葡萄糖，雙蒸餾水溶解。 （2）基礎(chǔ)培養(yǎng)基（MEM） ： 接種培養(yǎng)液： （3）接種培養(yǎng)液：用于胰酶消化后的細(xì)胞分散，做成細(xì)胞懸液，其成分為 MEM 含 1%谷氨酰胺，另加入 10%馬血清，當(dāng)天配制。 維持培養(yǎng)液：接種后 24h，全部換成此液，后每 2 周換一次，每次換 1/2。 （4）維持培養(yǎng)液 其成分為 MEM 中含 5%馬血清，1%谷氨酰胺，及適量的支持性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。 

二、培養(yǎng)基質(zhì) 常用鼠尾膠、小牛皮膠，多聚賴氨酸，再涂膠 消毒培養(yǎng)皿的備用。所有培養(yǎng)器皿均需清水沖洗 2-3d，達(dá)兩次 ddH2O，每遍 三、消毒培養(yǎng)皿的備用 洗刷 3-4 次，加塞包裝，置于烤箱中干燥消毒，于培養(yǎng)前 1 天進(jìn)行。 神經(jīng)細(xì)胞分散培養(yǎng) 

（一）選材 常用胚胎動(dòng)物或新生鼠神經(jīng)組織。雞胚常用胚齡 6-8d，新生鼠或胎 鼠（12-14d）或人胚胎。不過(guò)也有認(rèn)為與組織相關(guān)。如大白鼠胚胎以 19d 為宜， 小鼠以 18d 為宜，大鼠紋狀體以 10d 為宜；若紋狀體與黑質(zhì)聯(lián)合培養(yǎng)的大鼠胚， 則黑質(zhì)以 13d，紋狀體 18-21d 為宜；小腦以 20-21d 小鼠胚胎，所獲蒲氏細(xì)胞成活率高，顆粒細(xì)胞正在分化；脊髓與 DRG 聯(lián)合培養(yǎng)，常用 4-7d 雞胚或 12-14d 小鼠胚胎，取材易，神經(jīng)成活率高。  

（二）取材。腦則取出相應(yīng)組織，在解剖液中先剪碎，以使胰酶消化。脊髓則固 定于瓊脂板上，用小刀將其要成背腹兩側(cè)，分別培養(yǎng)。 

（三）細(xì)胞分離與接種 細(xì)胞分離與接種。神經(jīng)組織用 0.125-0.25%胰蛋白酶在 37℃孵育 30min， 移入接種液，停止消化，并洗去胰蛋白酶液，用細(xì)口吸管吹打細(xì)胞懸液，使其充 分分散，如此多次，待沉淀后吸出上層細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，預(yù)置細(xì)胞密度，接種于 培養(yǎng)皿（1×106） ，做電生理應(yīng)為 5×105 或更低。 

（四）抑制膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng) 或 5-FU 抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)。 抑制膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)。培養(yǎng) 3-5d 后，也有人認(rèn)為培養(yǎng) 7d 后，用阿糖胞苷。 

（五）觀察。接種 6-12h，開始貼壁，并有集合現(xiàn)象，細(xì)胞生長(zhǎng)突起明顯，5-7d 膠質(zhì)細(xì)胞增生明顯，7-10d 膠質(zhì)細(xì)胞成片于神經(jīng)細(xì)胞下面，形成地毯，2 周時(shí)神 經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)最豐滿，四周暈光明顯，一個(gè)月后，有些神經(jīng)細(xì)胞開始退化，變形， 甚至出現(xiàn)空泡，一般培養(yǎng) 2-4 周最宜。 但神經(jīng)細(xì)胞只能增大，而不能增殖，只能原代，不能傳代，不會(huì)有細(xì)胞周期，而 且隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)， 細(xì)胞數(shù)量在下降， 但膠質(zhì)細(xì)胞可以， 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞也可以。 在培養(yǎng)過(guò)程中，早期 9-12d 時(shí)，有較多的神經(jīng)細(xì)胞死亡，這是第一次死亡階段， 應(yīng)注意保持條件的恒定。在此之后存活下去的細(xì)胞一般突起長(zhǎng)而多，且相互形成 突觸。 常用培養(yǎng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)有： 

（六）常用培養(yǎng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)有：FCM 的蛋白總量分析；膜片鉗與離子通道的分析； 免疫組化分析； 但免疫組化分析應(yīng)注意，由于抗體直接作用于活細(xì)胞，不易穿透活細(xì)胞，故對(duì)核 內(nèi)抗原定位時(shí)，首先考慮膜對(duì)抗體的通透性問(wèn)題。常用化學(xué)試劑以增加其通透性 或采用冰凍方法解決。 在免疫組化中，或其它組織學(xué)染色中，常用不同的染色方法以區(qū)分不同細(xì)胞，如 半乳糖腦苷脂對(duì)小樹突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記明顯；GFAP 對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞具有特異性染 色等。這對(duì)研究神經(jīng)系統(tǒng)中膠質(zhì)細(xì)胞功能具有極大的應(yīng)用價(jià)值。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞以 往多被忽視，其在腦血管疾病（如缺血性損傷） 、退行性疾病（如 AD、PD） 、損 傷后膠質(zhì)細(xì)胞的填充等具有不可忽視的作用。 它也是神經(jīng)細(xì)胞功能和營(yíng)養(yǎng)支持的 物質(zhì)基礎(chǔ)。

第四節(jié) 肌組織細(xì)胞培養(yǎng)

各種肌組織均可用于培養(yǎng)，以心肌和骨骼肌較實(shí)用。 

（一）骨骼肌細(xì)胞培養(yǎng) 

1、出生 1 一 2 天的乳鼠，引頸處死。 

2、無(wú)菌取大腿肌組織，切成 0.3 一 0.5cm2 小塊后，用不含鈣鎂離子的 Hanks 液配的 0.25%胰蛋白酶消化，無(wú)菌紗網(wǎng)或紗布濾過(guò)。 

3、計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞密度。 

4、快接種量 2×106/皿入培養(yǎng)基培養(yǎng)。 

5、培養(yǎng)基內(nèi)含 10%小牛血清，可加 1%的胎汁以促進(jìn)分化。 接種在膠原或膠原的底物上能促進(jìn)細(xì)胞分化，明膠配置：用 Hanks 液配成 0.01% 明膠。 該細(xì)胞接種率約 50%，細(xì)胞生長(zhǎng)開始呈紡錘形，培養(yǎng) 50－52 小時(shí)后出現(xiàn)融合形 成肌細(xì)胞狀多核纖維。數(shù)日后融合停止，此時(shí)可觀察到橫紋，一般在融合后二、三天內(nèi)能見到收縮現(xiàn)象。 

（二）心肌細(xì)胞培養(yǎng) 

心肌細(xì)胞是最早的培養(yǎng)材料，Carrel 曾長(zhǎng)期培養(yǎng)過(guò)心肌組織，至今心肌仍不失 為好的培養(yǎng)物，最常用的是雞胚心肌。 心肌比較容易培養(yǎng)和生長(zhǎng)，可用懸滴培養(yǎng)、組織塊培養(yǎng)和消化培養(yǎng)法，均可獲良 好的效果。取心室肌培養(yǎng)較好，原代培養(yǎng)的雞胚心肌呈紡錘形，培養(yǎng)成功時(shí)，一 周后可見節(jié)律性收縮現(xiàn)象。

第五節(jié) 巨噬細(xì)胞培養(yǎng)

巨噬細(xì)胞屬免疫細(xì)胞，有多種功能，是研究細(xì)胞吞噬、細(xì)胞免疫和分子免疫學(xué)的 重要對(duì)象。巨噬細(xì)胞容易獲得，便于培養(yǎng)，并可進(jìn)行純化。巨噬細(xì)胞屬不繁殖細(xì) 胞群，在條件適宜下可生活 2－3 周，多用做原代培養(yǎng)，難以長(zhǎng)期生存。 巨噬細(xì)胞也建有無(wú)限細(xì)胞系，大多來(lái)自小鼠，如 P331、S774A.1、RAW309Cr.l 等，均獲惡性，培養(yǎng)中呈巨噬細(xì)胞形態(tài)和吞噬功能，易于傳代和瓶壁分離，但難 以建株。 培養(yǎng)巨噬細(xì)胞可用各樣方法和各種來(lái)源來(lái)獲取細(xì)胞， 以小鼠腹腔取材法最為實(shí)用， 其法如下： 1、實(shí)驗(yàn)前三天，向小鼠腹腔內(nèi)注入無(wú)菌硫羥乙酸肉湯 lml（勿注入腸內(nèi)！，以 ） 刺流產(chǎn)生大量的巨噬細(xì)胞。 2、引頸處死小鼠。 3、手提鼠尾將其全浸入 70%乙醇中 3－5 秒。 4、置動(dòng)物于解剖臺(tái)，用針頭固定四肢，持鑷撕開腹部皮膚，但勿傷及腹膜壁， 把皮膚拉向上下兩側(cè)，暴露出腹膜壁。 5、用 70%酒精擦洗腹膜壁，注射器吸 10ml Eagle 液注入腹腔中，同時(shí)用手指從 兩側(cè)壓揉腹膜壁，使液體在腹腔內(nèi)流動(dòng)。 6、 用針頭輕挑起腹壁并微傾向一側(cè)． 使腹腔中液體集中于針頭下吸取入針管內(nèi)。 7、小心拔出針頭，把液體注入離心管。 8、4℃下 250g 離心 10 分鐘后，去上清，加 10ml Eagle 培養(yǎng)基。 9、計(jì)數(shù)細(xì)胞。每只鼠可產(chǎn)生 20 一 30×106 細(xì)胞，其中 90%為巨噬細(xì)胞。 10、以 3×105 個(gè)貼附細(xì)胞/平方厘米接種。 11、接種數(shù)小時(shí)后，除去培養(yǎng)液，可去除其它白細(xì)胞，純化培養(yǎng)細(xì)胞，用 Eagle 液沖洗 1 一 2 次，再加新 Eagle 培養(yǎng)液置 CO2 溫箱中。 

第六節(jié) 腎小球分離、移植培養(yǎng)

SD 大鼠頸椎脫臼法處死，75%乙醇浸泡 1～2 分鐘，2 次，置超凈臺(tái)內(nèi)，打開腹腔 取出腎臟剪碎，置含 Hank's 液的無(wú)菌培養(yǎng)皿洗滌，置 80 目不銹鋼篩網(wǎng)上。用扁 平自制小鏟輕輕碾磨產(chǎn)物微小組織透過(guò)篩網(wǎng)，濾過(guò)組織 Hank's 液混合物用吸管 吸至 120 目不銹鋼篩網(wǎng)，濾過(guò)，去小組織塊，濾過(guò)物吸至 200 目不銹鋼篩網(wǎng)，輕 輕濾過(guò)， Hank's 液洗滌 1 次， 收集網(wǎng)上腎小球， 鏡下觀察為分離良好的腎小球。 腎小球用 0.2%胰酶、0.1%膠原酶，37℃消化 20 分鐘，加血清終止胰酶反應(yīng)，離 心除去膠原酶。處理過(guò)的腎小球計(jì)數(shù)后接種至 24 孔培養(yǎng)板或 25ml 培養(yǎng)瓶，使腎 小球大于 60 個(gè)/cm2，加培養(yǎng)基 5～10ml（培養(yǎng)基組成：F12—3T3 上清 1：1；5% 馬血清；2.5%胎牛血清；胰島素 5μg/ml；25ng/ml 氫化可的松；5μg/ml 轉(zhuǎn)鐵 蛋白；25ng/ml 前列腺素 E1；甲狀腺素 0.02ng/ml；D-纈氨酸 150ng/ml）腎小球培養(yǎng) 8～10 天，去除腎小球未生長(zhǎng)組分，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng) 24 小時(shí)，形態(tài)學(xué)觀察： 細(xì)胞生長(zhǎng)成單層多角型細(xì)胞，直徑約 100μm。

第七節(jié) 裸小鼠移植瘤單細(xì)胞分離培養(yǎng)

無(wú)菌條件下取出小鼠移植瘤組織，剪成 1mm3 小塊，用 0.5%膠原酶室溫消化 30 分鐘到 1 小時(shí)，再加等體積 0.2%胰酶消化 5～8 分鐘，在消化過(guò)程中用吸管吹打 組織塊或用自制裝置 （分別作為加樣和收集器的兩個(gè)注射器中間加一小濾器連接 而成，濾器中間墊兩層絲質(zhì)材料以隔斷組織塊與單細(xì)胞）來(lái)回推動(dòng)注射器吹打組 織以分離單細(xì)胞，終止酶消化方法同上。 常規(guī)方法接種培養(yǎng)收獲細(xì)胞。