循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulatingtumorcells,CTCs)是指從原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移灶脫落、發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)入患者外周血血液循環(huán)的惡性腫瘤細(xì)胞.CTCs在腫瘤研究和臨床診斷上的作用逐漸得到認(rèn)可,外周血中CTCs存在與否以及數(shù)量多少不但可以用于腫瘤的早期診斷,還可以用于評(píng)估腫瘤預(yù)后、監(jiān)測(cè)腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā).微流控芯片作為一個(gè)高通量、小型化的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)平臺(tái),已被應(yīng)用于CTCs的分選當(dāng)中.本文綜述了用于CTCs捕獲的微流控芯片系統(tǒng)的最新研究進(jìn)展,著重介紹各類芯片的捕獲原理、芯片結(jié)構(gòu)和捕獲效率,最后對(duì)微流控芯片技術(shù)在CTCs分選中的應(yīng)用前景進(jìn)行了展望.

惡性腫瘤已成為我國(guó)死亡率最高的重大疾病之一，90%以上的腫瘤病人死于腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā).循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulatingtumorcells，CTCs)是從實(shí)體瘤或轉(zhuǎn)移灶脫落，發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)進(jìn)入外周血血液循環(huán)的惡性腫瘤細(xì)胞，被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的必要前提.微環(huán)境改變的條件下，CTCs又發(fā)生間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化(mesenchymal-epithelialtransition，MET)而在遠(yuǎn)端器官中停留，生成新的腫瘤，從而導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移.CTCs檢測(cè)在新的腫瘤生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)、腫瘤預(yù)后判斷及個(gè)體化治療方面存在很大的應(yīng)用潛力，是國(guó)內(nèi)外腫瘤研究的熱點(diǎn)之一.然而，CTCs在血液中的數(shù)量非常少，109個(gè)血細(xì)胞中僅含有1～10個(gè)CTCs，因此，CTCs研究的關(guān)鍵在于從含有大量血細(xì)胞的復(fù)雜血液樣本中準(zhǔn)確、高效地將其分選出來(lái)，滿足高捕獲率、高純度和高通量的要求，進(jìn)而成為能夠滿足科研和臨床需求的工具.a.高捕獲率，即可以將樣品中的CTCs盡可能多地分離出來(lái)；b.高純度，即希望分離出來(lái)的細(xì)胞只含有CTCs，其他細(xì)胞的含量很少或沒(méi)有，收集到的CTCs可以進(jìn)行表型和基因型分析；c.高通量，即能短時(shí)間內(nèi)處理大量樣品.

目前，唯一通過(guò)美國(guó)食品和藥品監(jiān)督管理局(FDA)認(rèn)證的CTCs分離和計(jì)數(shù)系統(tǒng)是CellSearch，它是一個(gè)依賴于免疫磁珠原理的半自動(dòng)化工作系統(tǒng).該系統(tǒng)通過(guò)連接了抗上皮細(xì)胞黏附分子抗體(epithelialcelladhesionmolecule，EpCAM)的磁珠和CTCs表面標(biāo)志物EpCAM特異性結(jié)合，達(dá)到捕獲CTCs的目的.CTCs的識(shí)別使用經(jīng)典的免疫染色法.該系統(tǒng)分選CTCs效率為80%.盡管CellSearch已通過(guò)FDA批準(zhǔn)，但該系統(tǒng)還存在一些缺點(diǎn)，比如暫未實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)分選、假陽(yáng)性比率高、富集后的CTCs沒(méi)有生物活性等，更重要的是，CellSearch捕獲到的CTCs僅僅是EpCAM陽(yáng)性的類型，而許多惡性程度很高的CTCs并不表達(dá)EpCAM，從而無(wú)法被檢測(cè)出來(lái).微流控芯片是一個(gè)集樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測(cè)等功能于一體的小型分析實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，它通過(guò)微加工技術(shù)，在硅、玻璃、聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)等材料上，根據(jù)實(shí)際需求，制作出各種結(jié)構(gòu)的、尺寸在微米量級(jí)的管道進(jìn)行實(shí)驗(yàn).將原來(lái)需要在一個(gè)綜合實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成的工作簡(jiǎn)化到一個(gè)微小的芯片上，不僅減少了耗材和試劑的消耗、大大降低了成本，而且提高了檢測(cè)的靈敏度和分析速度，具有自動(dòng)和高效的優(yōu)點(diǎn).

隨著微流控芯片技術(shù)在細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng)用不斷擴(kuò)展，微流控芯片具有的可集成樣品預(yù)處理和分析為一體的優(yōu)勢(shì)，在DNA測(cè)序、蛋白質(zhì)檢測(cè)、細(xì)胞操控和胞內(nèi)成分分析等研究領(lǐng)域顯示出巨大的應(yīng)用潛力.由于微流控芯片管道尺寸在微米量級(jí)和細(xì)胞尺寸匹配，非常適合應(yīng)用于細(xì)胞分選，近些年來(lái)，有越來(lái)越多的研究者將該技術(shù)應(yīng)用在CTCs的分選上.

微流控芯片分選和富集CTCs的原理主要分為4類：a.利用抗原抗體親和性進(jìn)行分選；b.利用細(xì)胞物理特征的不同進(jìn)行分選，比如細(xì)胞大小、變形性以及不同大小的細(xì)胞在流場(chǎng)中的力學(xué)特性；c.利用免疫磁珠具有磁性兼連接抗體的作用進(jìn)行分選；d.利用不同細(xì)胞的電學(xué)性能差異進(jìn)行分選等.本文依據(jù)不同的CTCs分選原理，總結(jié)了近年來(lái)利用微流控芯片分離、富集CTCs的研究現(xiàn)狀和最新進(jìn)展.

1親和性分選法

利用親和性反應(yīng)(affinityreaction)原理進(jìn)行細(xì)胞分選是微流控芯片上最經(jīng)典、最常用的方法之一(圖1a)，具體步驟是在芯片內(nèi)部的微通道或微結(jié)構(gòu)上修飾能夠與目的細(xì)胞表面抗原結(jié)合的特異性抗體或適配體，比如上皮細(xì)胞黏附分子，當(dāng)樣品流經(jīng)微通道時(shí)，目的細(xì)胞表面抗原與微通道或微結(jié)構(gòu)上的特異性抗體或適配體結(jié)合，細(xì)胞被固定在芯片內(nèi)，其他細(xì)胞隨緩沖液流出芯片；再用合適的方法，比如更換緩沖液，洗脫并收集目的細(xì)胞進(jìn)行下游分析.

圖1微流控芯片捕獲CTCs各類芯片結(jié)構(gòu)示意圖

(a) 親和性分選法(A:親和性分選芯片原理示意圖;B:親和性分選芯片系統(tǒng)裝置及芯片內(nèi)部微柱顯微照片).(b)物理特征分選法(C:大小-變形性分選微柱捕獲示意圖;D:大小-變形性分選微孔捕獲示意圖;E:確定性側(cè)向位移芯片示意圖).(c)免疫磁珠分選法(F:免疫磁珠捕獲原理示意圖;G:磁珠和大小-變形性方法結(jié)合捕獲示意圖，細(xì)胞與磁珠結(jié)合后，尺寸增加，更有利于細(xì)胞被捕獲).(d)雙向電泳分選法示意圖.

He等設(shè)計(jì)了一種由TiO2納米顆粒制備的具有生物相容性納米薄膜，在玻璃基底中旋涂這種納米薄膜，再在薄膜上修飾EpCAM抗體，樣品通過(guò)芯片時(shí)，CTCs結(jié)合在納米薄膜上而留在芯片中.該研究將人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116混入健康人血液作為待測(cè)樣品，成功分離出HCT116細(xì)胞，其效率約為80%.這種由納米顆粒組成的納米薄膜可以增加抗體和細(xì)胞表面抗原之間的接觸機(jī)率.通過(guò)加大流體剪切力可將約50%的被捕獲細(xì)胞洗脫下來(lái)，洗脫下來(lái)的細(xì)胞具有生物活性，可進(jìn)行體外培養(yǎng).Sheng等制作了幾何增強(qiáng)混合(geometricallyenhancedmixing)芯片，簡(jiǎn)稱“GEMchip”，芯片大小與載玻片相同，芯片中有很多魚(yú)脊形或V形結(jié)構(gòu)，8個(gè)并聯(lián)管道用以加大通量.這種芯片通過(guò)內(nèi)部的魚(yú)脊形或V形結(jié)構(gòu)形成渦流，從而提高細(xì)胞與抗體之間的接觸機(jī)率，有利于目的細(xì)胞與芯片結(jié)構(gòu)內(nèi)修飾的抗體結(jié)合，從而高效捕獲CTCs.該研究將人胰腺癌細(xì)胞混入健康人血液作為待測(cè)樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，捕獲效率高達(dá)90%，同樣，被捕獲的腫瘤細(xì)胞可以被洗脫并繼續(xù)培養(yǎng)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).Launiere等設(shè)計(jì)了一種內(nèi)部連接EpCAM和E選擇素(E-selectin)的雙抗體芯片，E選擇素用于加大腫瘤細(xì)胞在所受流體剪切力作用下的捕獲效率，與其結(jié)合的白細(xì)胞可以用一種螯合鈣的緩沖液洗脫下來(lái)，腫瘤細(xì)胞則留在芯片內(nèi).文中還用只修飾EpCAM抗體的芯片作為對(duì)比，證明這種方法的捕獲效率是只修飾EpCAM抗體的芯片捕獲效率的1.9倍.Nagrath等設(shè)計(jì)了具有微柱陣列結(jié)構(gòu)CTCs捕獲芯片，實(shí)驗(yàn)了不同癌細(xì)胞系EpCAM表達(dá)水平，對(duì)于人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCI-H165的PBS懸液捕獲效率高達(dá)99%，對(duì)于116例腫瘤轉(zhuǎn)移患者(包括前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌)血液，有115例捕獲到了數(shù)量不等的CTCs.其他利用親和性原理捕獲CTCs的微流控芯片整理列于表1.

表1親和性分選法捕獲CTCs文獻(xiàn)總結(jié)

親和性分選法有特異性高的優(yōu)點(diǎn)，能有效分選形狀、大小相似的不同種類細(xì)胞.目前大部分研究者采用EpCAM作為CTCs的表面特異性抗原，但是在不同的腫瘤亞型中，EpCAM的表達(dá)各不相同，例如乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231的EpCAM表達(dá)水平不同，并且當(dāng)腫瘤細(xì)胞通過(guò)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)作用傳播時(shí)，EpCAM和角蛋白(CKs)的表達(dá)下調(diào)，波形蛋白(vimentin)和N-鈣黏素(N-cardherin)表達(dá)上調(diào).依賴EpCAM的CTCs分選芯片會(huì)丟失不表達(dá)或低表達(dá)EpCAM的CTCs，然而這些CTCs具有更大的浸潤(rùn)性和侵入性.因此，缺乏公認(rèn)的表面標(biāo)志物限制了親和性分選在CTCs分選中的應(yīng)用.另外，親和性分選法要在通量和效率之間權(quán)衡，流速越大，CTCs和抗體反應(yīng)的時(shí)間越少，這會(huì)導(dǎo)致分選效率降低.親和性分選法與大小變形性分選法相結(jié)合，或使用多抗體修飾的芯片分選CTCs也許是個(gè)不錯(cuò)的解決辦法，但不同種類抗體的反應(yīng)緩沖液以及反應(yīng)條件各不相同，實(shí)驗(yàn)成本也會(huì)隨之增加.因此，增加芯片內(nèi)部結(jié)構(gòu)與細(xì)胞接觸的面積和機(jī)率，在芯片內(nèi)部修飾多種抗體捕獲不同蛋白質(zhì)表達(dá)的CTCs，是利用親和性分選法原理分離CTCs的微流控芯片發(fā)展的主要方向.另外這種方法非常適合分選已知表面抗原的目的細(xì)胞，比如血液中的一些免疫細(xì)胞等.

2物理特征分選

微流控芯片進(jìn)行CTCs分選，常根據(jù)CTCs與血細(xì)胞物理特性(如變形性、大小、流體力學(xué)特性等)的差異，通過(guò)在芯片中設(shè)置不同的微結(jié)構(gòu)單元將其從血液中分離出來(lái)，常用的微結(jié)構(gòu)包括微孔、微過(guò)濾網(wǎng)和微柱等.

2.1基于細(xì)胞大小和變形性差異

大多數(shù)上皮來(lái)源的CTCs直徑從14～26μm不等，而白細(xì)胞直徑從8～20μm不等.通過(guò)在芯片內(nèi)部設(shè)計(jì)不同的小于CTCs直徑的微孔、微過(guò)濾網(wǎng)、微柱等結(jié)構(gòu)(圖1b(C、D))，當(dāng)含有CTCs的樣品流經(jīng)芯片時(shí)，CTCs由于直徑大而被卡在結(jié)構(gòu)內(nèi)，血細(xì)胞則隨緩沖液一起流出，較大的白細(xì)胞被結(jié)構(gòu)捕獲時(shí)，由于CTCs比白細(xì)胞變形性小，加大緩沖液流速時(shí)，白細(xì)胞被沖走，CTCs則留在芯片內(nèi)，從而達(dá)到分離目的.Abnova公司的ClearCell?System就是基于此原理分離CTCs的代表，該系統(tǒng)還可以動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)CTCs的捕獲過(guò)程.芯片主要結(jié)構(gòu)由圓柱形微柱構(gòu)成，每個(gè)捕獲單元由三個(gè)圓柱排列組成一個(gè)“爪形”結(jié)構(gòu).捕獲后的CTCs可以進(jìn)行染色鑒別和計(jì)數(shù)，亦可被重新收集繼續(xù)培養(yǎng)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，如研究CTCs的分子生物學(xué)特征、建立動(dòng)物模型、臨床個(gè)體病例研究等.

Lim等設(shè)計(jì)了一種微篩芯片，該芯片由硅片加工而成，其捕獲單元為包含105個(gè)小孔的微陣列，蠕動(dòng)泵將血液樣品從芯片上方泵入進(jìn)行捕獲.該系統(tǒng)捕獲摻在健康人血液中的MCF-7和HepG2細(xì)胞的效率在80%以上.該作者又用8例癌癥病人血液樣品進(jìn)一步驗(yàn)證了該系統(tǒng)的可靠性，成功從病人血液中分離出CTCs，整個(gè)處理過(guò)程僅需1.5h.Hosokawa等[29]則用微腔陣列(microcavityarray，MCA)系統(tǒng)捕獲CTCs，該系統(tǒng)的核心結(jié)構(gòu)由100×100個(gè)8～9μm直徑的圓孔陣列組成，芯片下面連接蠕動(dòng)泵.實(shí)驗(yàn)中，NCI-H358細(xì)胞混在血液中，蠕動(dòng)泵將樣品從蓄液池吸入芯片，血細(xì)胞通過(guò)圓孔隨緩沖液流出，腫瘤細(xì)胞則由于負(fù)壓作用被固定在圓孔上從而被成功分離.該系統(tǒng)可將混在1ml血液中的10個(gè)腫瘤細(xì)胞在15min內(nèi)完全捕獲，并且保持細(xì)胞活性.染色鑒別結(jié)果證明其分選效率高達(dá)97%，大大高于同一實(shí)驗(yàn)樣本采用CellSearch系統(tǒng)的分選效率.Jin等設(shè)計(jì)了一種不同間距的“棘齒”型微柱陣列捕獲芯片，間距依次從18μm到2μm遞減，進(jìn)入芯片的樣品呈振蕩流，與垂直方向的液流耦合，通過(guò)調(diào)整壓力和流速，腫瘤細(xì)胞和血細(xì)胞在芯片內(nèi)實(shí)現(xiàn)分離，人膀胱癌細(xì)胞摻在健康人血液中的樣品分離效率在70%以上.Lv等設(shè)計(jì)了一種間距漸變式捕獲芯片，該芯片結(jié)構(gòu)分為過(guò)濾和捕獲兩個(gè)部分.過(guò)濾部分的作用是濾掉血液中的雜質(zhì)，最大限度減少芯片堵塞；捕獲部分則設(shè)計(jì)了不同間距微柱，間距從12μm到4μm遞減，血細(xì)胞可通過(guò)微柱，而腫瘤細(xì)胞則被捕獲，腫瘤細(xì)胞混入磷酸鹽緩沖液(phosphatebufferedsaline，PBS)懸液樣品的捕獲效率高達(dá)90%以上.其他基于細(xì)胞大小和變形性差異原理捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞的微流控芯片整理列于表2.

表2基于細(xì)胞大小和變形性差異捕獲CTCs文獻(xiàn)總結(jié)

基于細(xì)胞大小和變形性差異分選法捕獲CTCs的優(yōu)勢(shì)在于：a.操作過(guò)程簡(jiǎn)單，樣品只需用緩沖液稀釋，不需要進(jìn)行染色標(biāo)記，檢測(cè)時(shí)直接將稀釋后的全血通入芯片，在出口處收集細(xì)胞即可；b.捕獲效率高；c.能夠?qū)崿F(xiàn)高通量分選；d.成本遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于CellSearch；e.無(wú)需依賴表面標(biāo)志物，分選出的CTCs可以用多種抗體進(jìn)行標(biāo)志物鑒別.該方法存在的問(wèn)題是僅僅基于細(xì)胞尺寸和變形性不同而進(jìn)行過(guò)濾式分選，由于CTCs尺寸和白細(xì)胞有重疊部分，CTCs有可能會(huì)通過(guò)濾網(wǎng)或微柱的間隔，然而這些CTCs由于經(jīng)歷了EMT作用而具有間質(zhì)細(xì)胞特性，更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，惡性程度更高；而且在較大的機(jī)械力作用下，CTCs隨著緩沖液流過(guò)微柱或者濾網(wǎng)時(shí)容易破裂.這些因素會(huì)對(duì)分離純度和細(xì)胞活性造成一定影響，這類芯片在設(shè)計(jì)內(nèi)部捕獲單元時(shí)應(yīng)避免使用帶棱角的微柱，比如三角形、長(zhǎng)方形、正方形等，而改用圓形、橢圓形等微柱，減少對(duì)細(xì)胞的損傷.

2.2基于細(xì)胞力學(xué)性質(zhì)差異

2.2.1基于慣性力

近年來(lái)，有研究者利用慣性力與微流控芯片結(jié)合的慣性微流技術(shù)(inertialfocusing)進(jìn)行CTCs分選，該方法的分離原理簡(jiǎn)述如下：當(dāng)流體在直線型微通道內(nèi)呈層流流動(dòng)時(shí)，懸浮在其中的細(xì)胞會(huì)受到梯度剪切升力(shear-gradientliftforce)和管壁效應(yīng)升力(walleffectliftforce)的作用，在二者的共同作用下，大小不同的細(xì)胞產(chǎn)生不同的流動(dòng)特性，再結(jié)合不同的芯片內(nèi)部結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，便可達(dá)到捕獲CTCs的目的.

Sollier等設(shè)計(jì)了一種具有8聯(lián)排并聯(lián)管道、每條管道有8個(gè)儲(chǔ)液囊的高通量分選芯片.樣品流經(jīng)芯片管道時(shí)，細(xì)胞受到管壁效應(yīng)升力和梯度剪切升力共同作用，一旦細(xì)胞流經(jīng)儲(chǔ)液囊，管壁效應(yīng)升力就會(huì)減弱，直徑較大的腫瘤細(xì)胞受較大的梯度剪切升力遠(yuǎn)離管道中心分界線進(jìn)入儲(chǔ)液囊，直徑較小的血細(xì)胞留在主流體中.該系統(tǒng)分離人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和肺癌細(xì)胞A549摻入健康人血液樣品的效率可達(dá)85%，作者還用該系統(tǒng)成功地從癌癥病人的血液樣本中分離出CTCs.

2.2.2確定性側(cè)向位移

基于確定性側(cè)向位移法(deterministiclateraldisplacement，DLD)設(shè)計(jì)的微流控芯片原理是芯片內(nèi)具有相對(duì)于流體流動(dòng)方向呈一定角度的微柱陣列，尺寸不同的顆粒在流動(dòng)過(guò)程中具有不同的運(yùn)動(dòng)軌跡，尺寸大的顆粒會(huì)發(fā)生側(cè)向位移向一側(cè)匯聚，尺寸小的顆粒會(huì)按原軌跡運(yùn)動(dòng)，在芯片上設(shè)計(jì)相應(yīng)的兩個(gè)出口，即可收集到相應(yīng)的細(xì)胞(圖1b(E)).Morton等[41]和Davis等的研究證明此方法適用于直徑從30nm～100μm范圍內(nèi)的顆粒分離；Loutherback等第一次證明使用此方法可以在數(shù)分鐘內(nèi)分離CTCs.芯片整體尺寸為2.5mm寬、25mm長(zhǎng)，微結(jié)構(gòu)中三角柱邊長(zhǎng)58μm、間距42μm，排列與液流方向呈1/20弧度角.和圓形柱相比，三角柱更有利于防止堵塞.液體流過(guò)具有一定排列角度的微柱時(shí)，直徑較大的腫瘤細(xì)胞會(huì)向芯片側(cè)壁富集，隨液體流出，通過(guò)收集側(cè)壁出口處的液體，即可得到腫瘤細(xì)胞.該系統(tǒng)分離混有人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的PBS懸液樣品效率在85%以上.將MDA-MB-231細(xì)胞摻入健康人血液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，捕獲后的細(xì)胞可保持活性，可用于繼續(xù)培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分析.除以上提到的幾種典型的分離方法之外，其他基于細(xì)胞力學(xué)性質(zhì)差異捕獲CTCs的微流控芯片整理于表3.

表3基于細(xì)胞力學(xué)性質(zhì)差異捕獲CTCs文獻(xiàn)總結(jié)

基于細(xì)胞力學(xué)性質(zhì)差異分選同基于細(xì)胞大小和變形性差異分選一樣，裝置簡(jiǎn)單、無(wú)需復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)設(shè)備、成本低，可以作為一個(gè)單元與其他微流控分選系統(tǒng)相結(jié)合，通過(guò)優(yōu)化細(xì)胞分選結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)更高的分選效率.樣品無(wú)需標(biāo)記，不影響CTCs分子特性和表面標(biāo)志物；細(xì)胞在微流環(huán)境中損傷小，分選后細(xì)胞的存活率更高，可繼續(xù)培養(yǎng)和做后續(xù)分析.然而，由于血液的復(fù)雜性，細(xì)胞間的相互作用不容易控制，當(dāng)處理細(xì)胞濃度較高的樣品時(shí)，分選效率降低.另外，該方法單純基于細(xì)胞的物理特性實(shí)現(xiàn)，而人體血液是高度復(fù)雜的血漿、紅白細(xì)胞、血小板、蛋白質(zhì)混合物，且血液黏度是水的3倍以上，因此芯片有時(shí)容易發(fā)生堵塞現(xiàn)象，影響分選效率，分選出的CTCs可能存在假陽(yáng)性結(jié)果.綜上所述，在使用流體動(dòng)力學(xué)分選時(shí)，減少細(xì)胞間相互作用的樣品前處理必不可少，比如用牛血清白蛋白(bovineserumalbumin，BSA)的PBS作為緩沖液(僅限于裂解紅細(xì)胞后的樣品)，對(duì)血液進(jìn)行稀釋以及改進(jìn)微通道的幾何結(jié)構(gòu)等.基于力學(xué)性質(zhì)差異分選的方法除了可以分離CTCs外，還非常適合分離血液中的血漿、血小板等.

3免疫磁珠分選

免疫磁珠分選是根據(jù)免疫磁珠的原理設(shè)計(jì)的微流控芯片的方法，是免疫磁珠結(jié)合微流控芯片本身的優(yōu)勢(shì)所設(shè)計(jì)的芯片，免疫磁珠分選過(guò)程在微流控芯片內(nèi)進(jìn)行時(shí)，可使用微小磁鐵，節(jié)省試劑和耗材，另外，微流控芯片內(nèi)部可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要設(shè)計(jì)成多種微結(jié)構(gòu)，有利于增加帶磁珠的細(xì)胞與磁鐵碰撞機(jī)會(huì)，即增加了捕獲效率，因此，微流控芯片技術(shù)與免疫磁珠相結(jié)合，可使芯片兼具免疫磁珠和微流控芯片雙重優(yōu)勢(shì)，成為微流控芯片捕獲CTCs一種常用的方法(圖1c(F)).越來(lái)越多的研究表明，微流控芯片上利用免疫磁珠分選法分離CTCs能夠簡(jiǎn)化操作步驟、提高捕獲效率，再結(jié)合分子生物學(xué)檢測(cè)芯片進(jìn)行后續(xù)PCR、染色、細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)等步驟，能夠?qū)崿F(xiàn)檢測(cè)的連續(xù)化、集成化和自動(dòng)化.

Earhart等在氮化硅薄膜上鍍12μm厚的磁性軟坡莫合金，制成尺寸為7mm×7mm、過(guò)濾微孔直徑40μm的磁性濾網(wǎng)芯片.CTCs與磁性微球結(jié)合而被標(biāo)記，血液樣品流過(guò)濾網(wǎng)時(shí)，血細(xì)胞從微孔通過(guò)，而磁性微球標(biāo)記的CTCs則被捕獲在微孔邊緣.Kang等[55]設(shè)計(jì)了一種微磁-微流控CTCs分離芯片，該芯片有一條主管道，主管道兩邊有很多與之相通的小室，每個(gè)小室中均裝有磁鐵，當(dāng)樣品流經(jīng)主管道時(shí)，由于細(xì)胞在小室處所受的流體剪切力最小，已經(jīng)包被了磁珠的CTCs就會(huì)在磁場(chǎng)的作用下被捕獲在小室中.該系統(tǒng)所用樣品為在1ml小鼠血液中摻雜了2～80個(gè)不同數(shù)量的乳腺癌細(xì)胞，其捕獲效率可達(dá)90%，并且捕獲到的CTCs可正常培養(yǎng)7天.其他利用免疫磁珠原理捕獲細(xì)胞的微流控芯片整理于表4.

表4免疫磁珠分選法捕獲CTCs文獻(xiàn)總結(jié)

磁化作用不僅可以用在分離CTCs的微流控裝置上，還可以用在CTCs檢測(cè)的微流裝置上.Issadore等設(shè)計(jì)了一種利用霍爾效應(yīng)檢測(cè)和計(jì)數(shù)磁化CTCs的芯片.基底材料上裝配一個(gè)探測(cè)器陣列，探測(cè)器上游是流體聚焦管道，血液樣品先經(jīng)過(guò)這一管道形成單一細(xì)胞液流，每個(gè)磁化的CTCs經(jīng)過(guò)霍爾探測(cè)器時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生一個(gè)霍爾電壓，從而可實(shí)現(xiàn)CTCs計(jì)數(shù).該方法的準(zhǔn)確度高達(dá)100%，遠(yuǎn)高于CellSearch，該系統(tǒng)檢測(cè)效率為107個(gè)細(xì)胞/分鐘.通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化數(shù)據(jù)采集電極，該系統(tǒng)有望達(dá)到更高通量(109個(gè)細(xì)胞/分鐘).盡管該系統(tǒng)不能夠分離出CTCs，但是它效率高、準(zhǔn)確度高、不依賴于現(xiàn)有的光學(xué)檢測(cè)平臺(tái)，是一個(gè)自動(dòng)化、低成本、便攜式的CTCs計(jì)數(shù)工具.

免疫磁珠分選法選擇性高，靈敏度高，芯片管道無(wú)需修飾，其依賴磁性分選可很好地控制細(xì)胞捕獲與釋放.但是，由于樣品需與修飾抗體的磁珠孵育進(jìn)行預(yù)處理，與抗原-抗體親和力分選一樣，CTCs表面標(biāo)志物的選擇也成了免疫磁珠分選法一個(gè)限制因素，且孵育效果、清洗過(guò)程都會(huì)造成細(xì)胞損失，另外，磁性富集也會(huì)造成帶磁珠的細(xì)胞在入口處由于接觸磁鐵而聚集，在芯片入口和磁場(chǎng)區(qū)域之間加一段緩沖管道，可能會(huì)改善這種聚集現(xiàn)象.免疫磁珠與大小-變形性原理相結(jié)合(如圖1c(G))，或優(yōu)化芯片內(nèi)部結(jié)構(gòu)、使連接磁珠的細(xì)胞與磁鐵充分碰撞，都有利于提高芯片的捕獲效率.

4雙向電泳分選法

雙向電泳(dielectrophoresis，DEP)是微流控芯片上一種常用的細(xì)胞分選方法，其原理是不同類型的細(xì)胞在電場(chǎng)中介電性質(zhì)不同，所受介電力的大小和方向不同，在不同介電力作用下向不同方向移動(dòng)，在電場(chǎng)中實(shí)現(xiàn)目的細(xì)胞的分選(圖1d).

Alshareef等設(shè)計(jì)了一種帶有光學(xué)透明電極的DEP分選器，該芯片以丙烯酸塑料為頂層材料，玻璃為基底材料，利用不同細(xì)胞交流頻率不同的特性，從HCT-116細(xì)胞中成功分離出混入的MCF-7細(xì)胞，通過(guò)設(shè)置不同的參數(shù)，如交流電頻率、電壓、流速等，可對(duì)捕獲效率進(jìn)行優(yōu)化，分選效率可達(dá)到93%.其他利用雙向電泳原理捕獲細(xì)胞的微流控芯片整理于表5.

表5雙向電泳分選法捕獲CTCs文獻(xiàn)總結(jié)

雙向電泳法分選CTCs，可直接對(duì)細(xì)胞進(jìn)行選擇性操控，無(wú)需依賴于CTCs的特異性表面標(biāo)志物，方便對(duì)CTCs進(jìn)行計(jì)數(shù)，不同細(xì)胞介電特性不同使分選后純度高，此方法最大的優(yōu)勢(shì)是可將不同癌種表面標(biāo)志物表達(dá)相同、尺寸相似、形態(tài)相似的細(xì)胞分離出來(lái).但是在較大的流速下，微弱的電泳力沒(méi)有充足時(shí)間感應(yīng)流過(guò)的CTCs，從而難以達(dá)到快速分選.該方法存在的另一個(gè)問(wèn)題是電場(chǎng)力可能會(huì)對(duì)細(xì)胞活性和表面特性產(chǎn)生影響，不利于對(duì)CTCs進(jìn)行后續(xù)培養(yǎng)和分子特性分析.雙向電泳分選法分選時(shí)間長(zhǎng)，但準(zhǔn)確率高，因此，較適合于少量細(xì)胞的分選.

以上我們總結(jié)了近些年來(lái)用于CTCs捕獲的微流控芯片系統(tǒng)的最新研究進(jìn)展，抗原-抗體親和性分選法和免疫磁珠分選法特異性高，利用特異性抗體分選出的CTCs可用于進(jìn)行腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞物理特性差異的研究，而依靠物理特征差異分選出的CTCs可用于研究不同的表面標(biāo)志物表達(dá)，分選出不同表型的CTCs可進(jìn)行單細(xì)胞基因組測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等.微流控芯片技術(shù)由于其自身特點(diǎn)在細(xì)胞分選方面具有一定的優(yōu)勢(shì)，包括芯片體積小、速度快、通量高、操作簡(jiǎn)便、樣品和試劑消耗低、易在芯片上集成多用途功能部件等.經(jīng)過(guò)十多年的發(fā)展，該技術(shù)已經(jīng)在CTCs分選中越來(lái)越廣泛的應(yīng)用，有望在將來(lái)成為CTCs富集和檢測(cè)工具之一.該技術(shù)目前也面臨著一些技術(shù)上和臨床上的挑戰(zhàn)：芯片通道空間小，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中管道容易被堵塞；有些特殊的芯片造價(jià)昂貴不便于推廣應(yīng)用；在進(jìn)行細(xì)胞分選時(shí)，有些方法難以確保較高的細(xì)胞活性；缺乏統(tǒng)一的CTCs表面標(biāo)志物等.如何改進(jìn)微流控芯片技術(shù)在進(jìn)行細(xì)胞分選時(shí)所遇到的上述問(wèn)題，充分發(fā)揮其優(yōu)勢(shì)，將是接下來(lái)研究的關(guān)鍵.

CTCs檢測(cè)的靈敏度和可靠性非常重要，7.5ml血液中有1～5個(gè)CTCs在臨床上都是有意義的，假陰性和假陽(yáng)性都可能對(duì)樣品分析、臨床診斷產(chǎn)生重要影響.隨著納米技術(shù)的不斷發(fā)展，功能化納米材料修飾的微流控芯片廣泛應(yīng)用于CTCs的富集和檢測(cè)[77].適配體能提供特異性CTCs靶點(diǎn)，因此微流控芯片的應(yīng)用也許可以向研究基于新的CTCs捕獲探針(如核酸適配體探針等)方面發(fā)展，尋找特異性強(qiáng)的適配體探針，以提高CTCs檢測(cè)的可靠性.抗體連接的功能性納米粒子能夠?yàn)镃TCs與抗體的結(jié)合提供更大的接觸表面積，因此納米技術(shù)也成為細(xì)胞分選中備受矚目的一項(xiàng)新技術(shù).另外，采用多種捕獲方法相結(jié)合，充分利用各自的優(yōu)點(diǎn)設(shè)計(jì)CTCs捕獲微流控芯片是將來(lái)的發(fā)展趨勢(shì).Karabacak等開(kāi)發(fā)的利用確定性側(cè)向位移、慣性聚焦和磁場(chǎng)力分選CTCs的微流控芯片，稱為CTC-iChip，第一部分利用確定性側(cè)向位移將紅細(xì)胞、血小板與白細(xì)胞和CTCs分開(kāi)，白細(xì)胞和CTCs流入下一捕獲單元，第二部分利用彎曲的微管道將白細(xì)胞和CTCs按單細(xì)胞排列開(kāi)來(lái)，連接了抗白細(xì)胞表面抗原的抗體的磁珠與白細(xì)胞結(jié)合，第三部分的磁場(chǎng)力將連接磁珠的白細(xì)胞和CTCs分開(kāi)，收集口處即可收集CTCs，1h可處理8ml血液，捕獲率高達(dá)97%，該芯片已成功實(shí)現(xiàn)對(duì)癌癥患者外周血CTCs的捕獲，并可進(jìn)行后續(xù)培養(yǎng)、單細(xì)胞免疫染色和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析；Yu等利用該芯片分離的乳腺癌CTCs，并對(duì)捕獲到的CTCs進(jìn)行了EMT的動(dòng)態(tài)過(guò)程分析；還利用分離后培養(yǎng)的CTCs進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn).

現(xiàn)在多種多樣的CTCs分選微流控芯片已經(jīng)商業(yè)化或正在發(fā)展成為產(chǎn)品，比如依賴抗體的CTCs芯片(On-Q-ity，Waltham，MA)、依據(jù)大小變形性原理的ClearCellTM系統(tǒng)(ClearbridgeBioMedics，Singapore)、依據(jù)免疫磁珠的IsoFluxTM系統(tǒng)(Fluxion)、依據(jù)流體體動(dòng)力特征的ApostreamTM(Apocell)和根據(jù)雙向電泳原理的DEPArrayTM系統(tǒng)等.然而，不同設(shè)備在不同的實(shí)驗(yàn)室中，CTCs的檢測(cè)和計(jì)數(shù)難以確保重復(fù)，因此，開(kāi)發(fā)具有高度可重復(fù)性的CTCs微流控芯片檢測(cè)系統(tǒng)成為當(dāng)前研究的重點(diǎn)，只有這樣才能成為臨床上可靠、實(shí)用的工具，為CTCs檢測(cè)、預(yù)測(cè)病人預(yù)后情況、研究癌癥的多樣性以及生物學(xué)特征提供更多的可能.相信在不遠(yuǎn)的將來(lái)，微流控芯片技術(shù)在CTCs分離、富集方面的應(yīng)用將更加成熟，微流控芯片技術(shù)在臨床上的應(yīng)用更加廣泛.

（文章來(lái)源:呂曉慶,李雷,陳紅梅,陳鵬,劉靜《微流控芯片技術(shù)在循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離中的研究進(jìn)展》科學(xué)網(wǎng)科學(xué)網(wǎng)轉(zhuǎn)載僅供參考學(xué)習(xí)及傳遞有用信息，版權(quán)歸原作者所有，如侵犯權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)系刪除）