微流控分析芯片是通過(guò)微加工技術(shù)將微管道、微泵、微閥、微儲(chǔ)液器、微電極、微檢測(cè)元件、窗口和連接器等功能元器件，像集成電路一樣集成在芯片材料上的微全分析系統(tǒng)。微流控分析技術(shù)已經(jīng)成為重要的化學(xué)及生物分析手段，其分析的優(yōu)越性(材料及試劑的低耗、原位分析、快速實(shí)時(shí)等)在細(xì)胞、分子水平檢測(cè)得以應(yīng)用和展現(xiàn)，尤其在細(xì)胞研究及應(yīng)用方面，由于微流道尺度與細(xì)胞良好的相容性，可以在體外實(shí)現(xiàn)對(duì)體內(nèi)細(xì)胞環(huán)境的高度模擬，所以在生命科學(xué)中的細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞操縱、試樣處理及細(xì)胞檢測(cè)方面有諸多應(yīng)用，成為細(xì)胞及單個(gè)細(xì)胞實(shí)時(shí)檢測(cè)和研究的新平臺(tái)。許多微流控芯片研究致力于設(shè)計(jì)創(chuàng)造多功能微系統(tǒng)整合細(xì)胞檢測(cè)中的分析步驟，從而在微系統(tǒng)上實(shí)現(xiàn)細(xì)胞特別是單細(xì)胞生理、病理及藥理等方面的研究。微流控芯片自身的設(shè)計(jì)和制作技術(shù)、芯片上細(xì)胞研究模型和方法的建立離不開(kāi)檢測(cè)方法和技術(shù)的探索與應(yīng)用。

目前，微流控芯片上細(xì)胞研究中的檢測(cè)技術(shù)主要采用光學(xué)檢測(cè)和電化學(xué)檢測(cè)。光學(xué)檢測(cè)靈敏度高、設(shè)備簡(jiǎn)單且易于與微流控芯片相結(jié)合，更有潛力應(yīng)用于活細(xì)胞實(shí)時(shí)檢測(cè)。微流控芯片上光學(xué)檢測(cè)方法依原理可分為熒光檢測(cè)、化學(xué)發(fā)光和生物發(fā)光檢測(cè)、拉曼光譜檢測(cè)、折射率檢測(cè)、熱透鏡光譜檢測(cè)和表面等離子激元共振檢測(cè)等。本文對(duì)近年來(lái)微流控芯片上細(xì)胞研究中的光學(xué)檢測(cè)方法與技術(shù)進(jìn)行綜述。

1熒光(Fluorescence)檢測(cè)

熒光化合物在一定的激發(fā)波長(zhǎng)下可以釋放特定的熒光，而其它物質(zhì)對(duì)特定熒光物質(zhì)的信號(hào)交叉干擾很小，故而利用熒光光譜可以靈敏地檢測(cè)熒光物質(zhì)。熒光檢測(cè)靈敏度高且易與微流控芯片相結(jié)合，從而使其成為微流控技術(shù)中最主要的光學(xué)檢測(cè)方法之一。

熒光檢測(cè)初時(shí)主要通過(guò)對(duì)細(xì)胞成像顯示檢測(cè)芯片上細(xì)胞的生長(zhǎng)和活動(dòng)狀況，后來(lái)逐漸應(yīng)用到細(xì)胞膜和細(xì)胞組分的研究中。Yager研究組在微流控芯片上對(duì)大腸桿菌進(jìn)行溶膜、提取細(xì)胞中β-半乳糖苷酶，并用熒光標(biāo)記底物試鹵靈-半乳吡喃糖苷(RBG)檢測(cè)β-半乳糖苷酶含量，最大可以提取到165nmol/L的β-gal，應(yīng)用不同的流速設(shè)置還可以用于分析其它細(xì)胞組分。Farinas等在微流控芯片上用熒光檢測(cè)分析人T淋巴細(xì)胞的離子通道活動(dòng)情況，用毛細(xì)管從微培養(yǎng)板中吸取測(cè)試樣本與THP-1細(xì)胞混合并進(jìn)一步與微流道中的電勢(shì)敏感熒光染料混合，利用膜去極化和超極化時(shí)陰離子染料DiBAC4和陽(yáng)離子染料Syto62的熒光比率變化測(cè)量單細(xì)胞膜電勢(shì)，相對(duì)于膜片鉗技術(shù)而言，是一種簡(jiǎn)單的細(xì)胞離子通道活力檢測(cè)的方法。

激光誘導(dǎo)熒光(LIF)可以精確控制激發(fā)光的參數(shù)，其敏感性更高，檢出限一般在10－13～10－9mol/L之間，因而用LIF進(jìn)行微流控上細(xì)胞及其裂解物的檢測(cè)非常普遍。微流控芯片上LIF檢測(cè)有非共聚焦和共聚焦檢測(cè)系統(tǒng)兩種。激光共聚焦技術(shù)可以有效減小樣品照射體積，從而減小散射光對(duì)靈敏度的影響，因而共聚焦檢測(cè)系統(tǒng)的信噪比(SNR)較非共聚焦系統(tǒng)高。李永新等用LIF檢測(cè)微流控芯片上電泳分離的四種病原微生物DNA，可檢測(cè)出1×102cfu/mL的病原菌。Hellmich等用共聚焦LIF-微流控芯片系統(tǒng)(見(jiàn)圖1)檢測(cè)單細(xì)胞的裂解組分。系統(tǒng)在可見(jiàn)光區(qū)可檢測(cè)1×10－13mol/L的熒光素;在紫外區(qū)內(nèi)利用Trp、Tyr和Phe3種氨基酸的LIF特性完成對(duì)蛋白質(zhì)的分離和無(wú)熒光標(biāo)記檢測(cè)。他們后續(xù)通過(guò)減小入射激光的功率和校正共聚焦的針孔將蛋白質(zhì)和氨基酸的檢出限降低了2個(gè)數(shù)量級(jí);再通過(guò)在PDMS中整合炭黑顆粒和涂覆基于聚氧乙烯的三嵌段共聚物F108層芯片表面修飾進(jìn)一步提高了微流道中蛋白質(zhì)的分離效率和LIF檢測(cè)的敏感度，對(duì)氨基酸的檢出限達(dá)到2．5×10－8mol/L，并在芯片上實(shí)現(xiàn)對(duì)單細(xì)胞中低濃度蛋白質(zhì)的無(wú)標(biāo)記檢測(cè)。

圖1紫外和可見(jiàn)激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)系統(tǒng)

許多研究者在微流控?zé)晒鈾z測(cè)系統(tǒng)的小型化方面做了有益嘗試，將光源和其它微設(shè)備組件整合，發(fā)展出各種小型化系統(tǒng)用于細(xì)胞及生物分子分析。Joo等將一個(gè)發(fā)光二極管(LED)、一個(gè)固態(tài)光電倍增管(SSPM)、聚電解質(zhì)凝膠電極(PEGs)與玻璃微流控芯片組裝在體積15cm×10cm×10cm的微系統(tǒng)中，這個(gè)便攜式的微流控細(xì)胞計(jì)數(shù)器可以簡(jiǎn)單而快速地用電阻抗和熒光兩種檢測(cè)方式區(qū)分細(xì)胞和微粒子。Kuhn等設(shè)計(jì)出小型化的完全芯片整合的電光學(xué)陷阱，其激發(fā)能水平比常規(guī)光學(xué)陷阱低5個(gè)數(shù)量級(jí)，并運(yùn)用熒光檢測(cè)完成大腸桿菌DNA的光漂白動(dòng)力學(xué)研究。

微流控?zé)晒鈾z測(cè)靈敏性高，影響其自身靈敏度的因素主要來(lái)自瑞利和拉曼散射，同時(shí)芯片本身背景熒光的去除是提高檢測(cè)精確度的重要因素，此外檢測(cè)的小型化將更便于對(duì)細(xì)胞生理生化反應(yīng)的檢測(cè)。特異的熒光探針如量子點(diǎn)及免疫方法的結(jié)合，微流控表面圖案的設(shè)計(jì)可以省去對(duì)分析物的純化步驟，為芯片上實(shí)時(shí)、高靈敏度檢測(cè)提供思路。

2化學(xué)發(fā)光檢測(cè)和生物發(fā)光檢測(cè)

化學(xué)發(fā)光(Chemiluminescence，CL)或是生物發(fā)光(Bioluminescence，BL)的強(qiáng)度可以用于確定分析物的濃度，其靈敏度和選擇性高、線性反應(yīng)范圍寬，利于對(duì)分析物的定量分析。相比于LIF檢測(cè)，由于檢測(cè)不需要外來(lái)光源，因而減少了干擾，也簡(jiǎn)化了設(shè)備對(duì)光源的要求，只需要一個(gè)光電倍增管和光電二極管作為檢測(cè)器即可?；瘜W(xué)發(fā)光及生物發(fā)光檢測(cè)為微芯片檢測(cè)系統(tǒng)提供簡(jiǎn)單而相對(duì)便宜的設(shè)備，符合芯片實(shí)驗(yàn)室小型化發(fā)展趨勢(shì)。Heyries等利用化學(xué)發(fā)光在微流控芯片上實(shí)現(xiàn)對(duì)過(guò)敏特異抗體的檢測(cè)。用β-乳球蛋白、花生植物凝血素和人IgG3種蛋白質(zhì)作為過(guò)敏抗體檢測(cè)的捕捉試劑，經(jīng)過(guò)一種“PDMS彈性體大分子轉(zhuǎn)移”法固定在微流控芯片上。在經(jīng)流體實(shí)驗(yàn)得到的最優(yōu)流速(20μL/min)條件下對(duì)過(guò)敏病人的血清進(jìn)行測(cè)定，均得到陽(yáng)性免疫反應(yīng)。證明用微流控技術(shù)快速、靈敏地檢測(cè)蛋白質(zhì)的小型化學(xué)發(fā)光ELISA的可行性。

電化學(xué)發(fā)光(ECL)是由電化學(xué)反應(yīng)刺激而產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光。ECL不但保持了CL的優(yōu)點(diǎn)，而且光釋放反應(yīng)的時(shí)間和位點(diǎn)也可以由電化學(xué)反應(yīng)控制。ECL試劑的電化學(xué)循環(huán)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光試劑信號(hào)釋放，可以實(shí)現(xiàn)低檢出限檢測(cè)。檢測(cè)采用較多的是聯(lián)吡啶釕Ru(bpy)2+3反應(yīng)體系，也有許多采用三胺衍生物探針進(jìn)行羧酸類物質(zhì)的ECL檢測(cè)。Hosono等組裝了一個(gè)由PDMS基底流道和玻璃基底三電極組成的微流控系統(tǒng)，可以完成微流道傳輸、溶液混合和ECL檢測(cè)。通過(guò)控制流道中的兩個(gè)金電極傳輸并混合氨基酸溶液和聯(lián)吡啶釕Ru(bpy)2+3，再由混合通道中的鉑電極施加電場(chǎng)引發(fā)ECL進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)5種氨基酸Leu，Val，Pro，Lys和His，顯示ECL的強(qiáng)度與氨基酸濃度正相關(guān)，其中Pro的檢出限達(dá)到nmol/L級(jí)。之后在此系統(tǒng)中引入自動(dòng)化閥控制溶液混合并由芯片上電極電勢(shì)調(diào)節(jié)pH值的恒定，提高了自控性。Pittet等用印刷電路板(PCB)技術(shù)設(shè)計(jì)電極和封裝環(huán)氧基質(zhì)在微流控芯片上進(jìn)行ECL檢測(cè)，降低了系統(tǒng)成本。Naseri等則開(kāi)發(fā)了一種微流控芯片上注塑聚苯乙烯導(dǎo)電電極的技術(shù)，通過(guò)在其表面電子束蒸金或銀及電化學(xué)形成AgCl形成不同的電極，芯片系統(tǒng)可用于ECL和伏安法電化學(xué)檢測(cè)。

微流控芯片上BL檢測(cè)則利用細(xì)胞自身的發(fā)光性質(zhì)，如利用細(xì)胞中具有發(fā)光性質(zhì)的酶，然后依照外界物質(zhì)對(duì)其催化產(chǎn)生發(fā)光產(chǎn)物的BL信號(hào)的影響而檢測(cè)。Elman等首次開(kāi)發(fā)一個(gè)包含有全細(xì)胞傳感器、微光電機(jī)械系統(tǒng)(MOEMS)調(diào)幅器和固相光探測(cè)器的芯片系統(tǒng)(見(jiàn)圖2)。在細(xì)胞傳感器模塊中應(yīng)用轉(zhuǎn)化了lac啟動(dòng)子質(zhì)粒的E．Coli做為細(xì)胞傳感模塊，用IPTG(半乳糖苷酶基因的誘導(dǎo)劑)評(píng)價(jià)整個(gè)系統(tǒng)的檢測(cè)能力，能檢測(cè)到0．1mmol/LIPTG作用下細(xì)胞的BL，證明其應(yīng)用于細(xì)胞毒性檢測(cè)的潛力。Yoo等利用微流控芯片上固定的生物發(fā)光細(xì)菌檢測(cè)細(xì)胞毒性物質(zhì)。用聚乙烯乙醇-苯乙烯吡啶(PVA-SbQ)在芯片上固定細(xì)胞，生物發(fā)光隨著細(xì)胞氧化損傷程度增加而加強(qiáng)，0．88mmol/L過(guò)氧化氫的加入使得生物發(fā)光強(qiáng)度增加10倍。Liu等則設(shè)計(jì)了“Y”型微通道用于樣本制備、分離并進(jìn)行與ATP及ATP偶聯(lián)代謝的熒光素-熒光素酶BL檢測(cè)。定量分析表明ATP呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)的線性范圍，檢出限低至亞微摩爾。

CL和BL檢測(cè)選擇性和特異性高，但是只適合于特定化學(xué)發(fā)光試劑和細(xì)胞的研究，微流控芯片的設(shè)計(jì)中多個(gè)芯片層及分析檢測(cè)模塊的整合很重要。此外，ECL中電極的排布應(yīng)避免分離電極的影響，由此增加了芯片設(shè)計(jì)和制作的復(fù)雜度;選擇更廣泛的檢測(cè)試劑將會(huì)擴(kuò)大檢測(cè)的應(yīng)用范圍。

圖2整合的微光電機(jī)械系統(tǒng)(MOEMS)(a)和細(xì)胞傳感生物傳感芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)(b)

3.拉曼(Raman)檢測(cè)

拉曼光譜用來(lái)研究系統(tǒng)中分子的震動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)及其它低頻率震蕩模型，這些光譜提供的“化學(xué)指紋”可以用來(lái)鑒定特定分析物。不同于分子紅外光譜，極性分子和非極性分子都能產(chǎn)生拉曼光譜，而且由于水分子不會(huì)對(duì)其光譜產(chǎn)生影響，拉曼光譜不需要分析物絕對(duì)干燥。

激光誘導(dǎo)拉曼顯微術(shù)結(jié)合微流控芯片適于對(duì)微環(huán)境下樣本的混合、結(jié)構(gòu)性質(zhì)的原位探測(cè)，結(jié)合應(yīng)用納米探針、染料標(biāo)記、流道表面修飾、光學(xué)鑷子等技術(shù)對(duì)細(xì)胞及其代謝物無(wú)標(biāo)記實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，微芯片拉曼檢測(cè)是細(xì)胞分選、細(xì)胞藥理、病理研究的新平臺(tái)。Ramser等將共聚焦微拉曼裝置、光學(xué)鑷子及微流控系統(tǒng)相結(jié)合檢測(cè)單個(gè)紅細(xì)胞在環(huán)境刺激中其血紅蛋白的氧循環(huán)變化過(guò)程。采集微流道中光鑷束縛下紅細(xì)胞在近紅外區(qū)的拉曼共振光譜，光譜的變化與血紅蛋白在光誘導(dǎo)作用下的轉(zhuǎn)換變化相同。這使得細(xì)胞內(nèi)氧合作用循環(huán)的實(shí)時(shí)檢測(cè)和光誘導(dǎo)化學(xué)效應(yīng)的觀察成為可能。黃超等用類似體系檢測(cè)紅細(xì)胞，證明與常規(guī)方法相比，微流控拉曼檢測(cè)對(duì)正常及病例紅細(xì)胞的區(qū)分度更好，檢測(cè)進(jìn)程更快。Huang等利用吡啶二羧酸鈣(Ca-DPA)在1017cm－1的特異拉曼光譜，檢測(cè)光鑷束縛下桿菌類單個(gè)孢子中Ca-DPA含量變化，同時(shí)也研究了SpoVA蛋白在桿菌孢子化的過(guò)程中對(duì)Ca-DPA攝入的作用，在桿菌細(xì)胞孢子化的研究方法上有所創(chuàng)新。此外，Lau等開(kāi)發(fā)了一套拉曼激活細(xì)胞分選(RACS)體系進(jìn)行無(wú)標(biāo)記細(xì)胞識(shí)別和自動(dòng)化細(xì)胞連續(xù)分選，分選了兩種白血病細(xì)胞系。Wang等則利用相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)結(jié)合PDMS微流控裝置(見(jiàn)圖3)進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)量。在芯片上橫向聚焦液體核心掃描微流道中流動(dòng)目標(biāo)，對(duì)鼠脂肪細(xì)胞進(jìn)行數(shù)量測(cè)定。CARS有很強(qiáng)的反斯托克斯強(qiáng)度，其藍(lán)移導(dǎo)致其很容易與熒光分離，而且有確定的散射方向，比普通拉曼散射更易得到理想的檢測(cè)信號(hào)，故而CARS細(xì)胞計(jì)量術(shù)是一種較好的具有震動(dòng)選擇性的定量分析模式。

圖3CARS細(xì)胞計(jì)量檢測(cè)系統(tǒng)和芯片上流體聚焦效應(yīng)

表面加強(qiáng)拉曼散射(SERS)顯微術(shù)通過(guò)表面共振加強(qiáng)技術(shù)可進(jìn)一步提高拉曼光譜的靈敏度，SERS不僅可以對(duì)樣品進(jìn)行光譜研究，還能進(jìn)行功能性成像，提高了分子分析的信息量。Zhang等將微流控和SERS及共聚焦顯微分光鏡結(jié)合原位檢測(cè)單個(gè)CHO(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢)細(xì)胞的光譜，注入伊屋諾霉素連續(xù)流并監(jiān)測(cè)細(xì)胞在藥物誘發(fā)下Ca2+流的實(shí)時(shí)拉曼光譜反應(yīng)。這種方法可用于研究細(xì)胞對(duì)外界條件刺激下的響應(yīng)。Li等在硅基質(zhì)上刻蝕納米結(jié)構(gòu)形成模板，用此模板構(gòu)建具有納米結(jié)構(gòu)的PDMS微流道，然后在其上沉積銀膜，形成納米阱(nanowell)結(jié)構(gòu)，實(shí)驗(yàn)證明在納米阱上AgSERS基質(zhì)的拉曼散射信號(hào)比普通PDMS上平滑Ag鍍層的信號(hào)強(qiáng)107倍。此外，在微流道中形成微液滴再進(jìn)行SERS檢測(cè)也是一種有效的定量分析方法，細(xì)胞和微生物可被包被到微液滴中，然后進(jìn)行實(shí)時(shí)SERS檢測(cè)和定量分析。Popp等用SERS檢測(cè)微流道中液/液片流中的分析物，微片流的體積小至180nL。這種方法克服了常規(guī)粘附膠體/分析聚合物在光學(xué)玻璃上留下的曲線痕跡(即記憶效應(yīng))的影響，提高了定量分析的重復(fù)性。進(jìn)一步地用同位素標(biāo)記液液片流作為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行煙堿和吡啶SERS光譜的定量分析。這種微流道中內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的建立進(jìn)一步提高了SERS光譜分析的可重復(fù)性和對(duì)照性。

拉曼光譜的空間和時(shí)間分辨率高，適于對(duì)細(xì)胞及其生物分子的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，微流道表面的處理和樣液處理方式非常重要，檢測(cè)時(shí)要選擇微流控芯片的基質(zhì)種類和厚度及檢測(cè)波長(zhǎng)以減小背景熒光干擾。

4.折射率(Refractiveindex，RI)檢測(cè)

材料的折射率是電磁波在真空中的傳播速度與它在介質(zhì)中的傳播速度的比值，是一個(gè)衡量電磁波在材料內(nèi)部傳播減慢的物理量。折射率檢測(cè)對(duì)于環(huán)境溫度、壓力或是流速非常敏感，與微流控設(shè)備結(jié)合并精確地控制外部條件后可以檢測(cè)多種分析物，尤適于熒光等其它方法不能檢測(cè)的非離子、無(wú)紫外吸收、無(wú)熒光的物質(zhì)如蔗糖、PEG等的檢測(cè)。

細(xì)胞的折射率是一個(gè)顯著的細(xì)胞生物物理性質(zhì)，折射率依細(xì)胞和細(xì)胞核的大小及表面性質(zhì)的不同而有差異。折射率也對(duì)外圍的緩沖液非常敏感，對(duì)細(xì)胞RI的檢測(cè)有潛力用于癌癥和疾病的診斷。Lue等在微流道上對(duì)細(xì)胞用希爾伯特相顯微鏡法進(jìn)行定量相位顯像提取，測(cè)量培養(yǎng)細(xì)胞的平均折射率。而許多有效的RI檢測(cè)是在微流控芯片上構(gòu)造法布里-珀羅諧振腔，在其中固定單個(gè)細(xì)胞，然后依照細(xì)胞自身性質(zhì)的不同及測(cè)量條件的改變而區(qū)分不同單細(xì)胞。依此方法，Shao等在微流控芯片上實(shí)現(xiàn)了紅細(xì)胞、白細(xì)胞和酵母細(xì)胞的區(qū)分，也通過(guò)正常淋巴細(xì)胞和兩類淋巴癌細(xì)胞系(Oswald和1771)間細(xì)胞核的差異導(dǎo)致的內(nèi)腔式光譜的不同結(jié)合有效折射率模型計(jì)算區(qū)分細(xì)胞。Liu領(lǐng)導(dǎo)的研究組利用相同的原理設(shè)計(jì)小型RI檢測(cè)的微流控芯片并進(jìn)行對(duì)細(xì)胞RI檢測(cè)的研究。檢測(cè)系統(tǒng)由微芯片上微通道、小角膜接觸鏡和外部空腔激光器組成。光源是尺度為215μm×300μm×100μm的激光二極管，用鍍金的鏡面構(gòu)建外圍空腔，設(shè)計(jì)了一個(gè)微鏡頭使得激光器可以聚焦到單個(gè)細(xì)胞上。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，5種癌細(xì)胞的折射率(1．392～1．401)高于正常細(xì)胞的折射率(1．35～1．37)。隨后他們［47］在微流控芯片上構(gòu)建光柵共振腔，用光纖引導(dǎo)激光進(jìn)行單個(gè)活細(xì)胞RI檢測(cè)，微流控芯片集成細(xì)胞注入、液滴分離、緩沖液調(diào)節(jié)和纖維布拉格光柵(FBG)功能(見(jiàn)圖4)。這種光學(xué)陷阱技術(shù)減小了不確定因素和對(duì)細(xì)胞的損傷，使得單細(xì)胞檢測(cè)簡(jiǎn)便、無(wú)損。類似的，St-Gelais等發(fā)展了一個(gè)集成有垂直刻蝕的硅布拉格反射鏡的微芯片RI傳感器，進(jìn)行芯片上法布里-珀羅諧振光譜RI檢測(cè)，得到907nm/RIU敏感度和1．7×10－5RIU的分辨率。

圖4生物芯片和纖維布拉格光柵

此外，Ymeti等將一個(gè)光學(xué)四通道小干涉儀整合在微流控系統(tǒng)中，形成一個(gè)小型光學(xué)傳感系統(tǒng)。4個(gè)微流道為進(jìn)樣分析通道，而光學(xué)四通道小干涉儀為傳感窗口。在相互反應(yīng)長(zhǎng)度為4mm的情況下，折射率的分辨率相當(dāng)于6×10－8，對(duì)應(yīng)于蛋白質(zhì)的質(zhì)量覆蓋分辨率為20fg/mm2。Kim等通過(guò)掃描玻璃樣本中的激光脈沖串將光學(xué)波導(dǎo)結(jié)構(gòu)整合到微流道中進(jìn)行單個(gè)紅細(xì)胞處理和折射率及熒光檢測(cè)。

RI檢測(cè)避免了熒光標(biāo)記和化學(xué)修飾對(duì)細(xì)胞的影響，適于對(duì)細(xì)胞自然狀態(tài)的監(jiān)測(cè)。檢測(cè)對(duì)激光光源及對(duì)外部條件如溫度、壓力和流速的控制要求很高，特殊光學(xué)檢測(cè)結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)及光纖等的應(yīng)用使得微流控RI檢測(cè)系統(tǒng)更接近于芯片實(shí)驗(yàn)室的概念。

5.熱透鏡顯微(Thermallensmicroscopy，TLM)檢測(cè)

熱透鏡技術(shù)有兩個(gè)激光器產(chǎn)生兩柱激光，其中激發(fā)光柱激發(fā)樣本，探針光柱測(cè)量折射率的變化。由于光吸收分子的濃度與熱透鏡效應(yīng)成線性相關(guān)關(guān)系，所以通過(guò)測(cè)量由于TLS導(dǎo)致的探針光柱的會(huì)聚或分散可以進(jìn)行定量分析。TLM適于結(jié)合微流道檢測(cè)，因?yàn)槲⒘骺匦酒芯匦瘟鞯乐械臋z測(cè)比在圓形的毛細(xì)管中更容易校準(zhǔn)。Kitamori及其研究組在微流控芯片上細(xì)胞培養(yǎng)及TLM檢測(cè)分析方面多有建樹(shù)。

微流控芯片上細(xì)胞培養(yǎng)和對(duì)流體的控制，可以高度模擬細(xì)胞在體內(nèi)的真實(shí)環(huán)境，而TLM可以實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記地監(jiān)測(cè)細(xì)胞對(duì)外界刺激條件的響應(yīng)。Jang等用TLM在微流控芯片上研究了流體切應(yīng)力對(duì)成骨細(xì)胞分泌表達(dá)蛋白的影響。在連續(xù)灌流的玻璃微芯片系統(tǒng)中培養(yǎng)可表達(dá)GFP標(biāo)記基因的鼠MC-3T3E1成骨細(xì)胞，用TLM測(cè)量芯片上堿性磷酸酶(ALP)的表達(dá)，證明在微流道中，切應(yīng)力(0．07dyne/cm2)作用能增加成骨細(xì)胞的GFP表達(dá)和分化;另外在含有骨形成蛋白2的分化培養(yǎng)基中，微流道中細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ALP活性達(dá)到常規(guī)48孔板靜態(tài)培養(yǎng)下活性的10倍。此微芯片細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)能自動(dòng)化長(zhǎng)時(shí)期(10天)監(jiān)測(cè)細(xì)胞并進(jìn)行成骨細(xì)胞分化分析。Sato等用石英玻璃微流控芯片培養(yǎng)鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞模擬神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，然后將含有神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸的溶液注入到芯片上刺激培養(yǎng)的神經(jīng)元釋放逆行信使分子花生四烯酸，之后用UV-TLM檢測(cè)分析。測(cè)量的信號(hào)強(qiáng)度依賴于谷氨酸溶液的濃度，而且神經(jīng)元釋放逆行信使分子也與谷氨酸溶液的濃度相關(guān)。這個(gè)系統(tǒng)適合于細(xì)胞釋放超痕量化學(xué)物質(zhì)的時(shí)間變化監(jiān)測(cè)。

微流控芯片TLM檢測(cè)系統(tǒng)還可以模擬和監(jiān)測(cè)細(xì)胞體內(nèi)環(huán)境下對(duì)多種刺激條件的細(xì)胞響應(yīng)，用于代謝和藥物篩選。Goto等在玻璃芯片上培養(yǎng)巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞，通過(guò)控溫設(shè)備控制芯片3個(gè)不同區(qū)域溫度不同，然后用TLM監(jiān)測(cè)細(xì)胞在脂多糖刺激下NO的釋放過(guò)程(見(jiàn)圖5)。與常規(guī)方法相比，對(duì)于NO的檢出限從1×10－6mol/L降低到7×10－8mpl/L，檢測(cè)時(shí)間由24h縮短到4h。

TLM由于其高檢測(cè)靈敏性和高分辨率，還用于監(jiān)測(cè)微流道上單個(gè)細(xì)胞表面及內(nèi)部分子的分布情況，并且可以定量檢測(cè)識(shí)別目標(biāo)分子。Tamaki等［58］用小型TLM結(jié)合微芯片監(jiān)測(cè)成神經(jīng)細(xì)胞瘤-神經(jīng)膠質(zhì)瘤雜交細(xì)胞中細(xì)胞色素C在凋亡過(guò)程中由線粒體到胞質(zhì)溶膠中的分布過(guò)程。在芯片微槽(體積為1μL)中培養(yǎng)細(xì)胞以模擬細(xì)胞的體內(nèi)環(huán)境，在微流道進(jìn)行流體操縱和檢測(cè)，細(xì)胞色素C的含量約為10－20mol。此外Kakuta等發(fā)展了一種芯片上TLM免疫分析檢測(cè)方法，在凝膠上檢測(cè)了腦鈉素與其抗體相互作用的結(jié)合活性。

TLM檢測(cè)極其靈敏，與微流控結(jié)合對(duì)于細(xì)胞研究的模型已經(jīng)建立起來(lái)，可以對(duì)單個(gè)細(xì)胞無(wú)創(chuàng)、實(shí)時(shí)檢測(cè)，將是微系統(tǒng)的一個(gè)重要發(fā)展應(yīng)用技術(shù)。檢測(cè)時(shí)需要精細(xì)的光學(xué)校準(zhǔn)以達(dá)到檢測(cè)的最佳配置。

圖5基于微芯片的生物分析系統(tǒng)

6.表面等離子激元共振(Surfaceplasmonresonance，SPR)檢測(cè)

微流控SPR檢測(cè)最主要的特點(diǎn)是對(duì)界面上生物分子相互作用的無(wú)標(biāo)記實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，通過(guò)對(duì)生物反應(yīng)過(guò)程中SPR的動(dòng)態(tài)變化監(jiān)測(cè)獲取生物分子相互作用的特異信號(hào)。檢測(cè)對(duì)象一般是具有配體和受體特異結(jié)合性質(zhì)的核酸、蛋白質(zhì)、酶及抗體等生物分子，尤其適合對(duì)免疫反應(yīng)的過(guò)程監(jiān)測(cè)和定量分析，這種對(duì)分子特異反應(yīng)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)也用于細(xì)胞的檢測(cè)和傳感。

微流控芯片對(duì)流體的控制可以減少反應(yīng)時(shí)間和樣本消耗，同時(shí)增加配體與膜表面受體的結(jié)合特性，SPR圖像實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)生物分子復(fù)合體的形成及變化。Garcia-Aljaro等用微流控SPR傳感器檢測(cè)廢水中的大腸桿菌噬菌體。利用卵白素-生物素將噬菌體宿主E．coliWG5固定在金傳感芯片上，然后加入大腸桿菌噬菌體檢測(cè)SPR的特異信號(hào)。噬菌體-宿主間相互作用使E．coliWG5裂解使得傳感芯片表面質(zhì)量密度增加，實(shí)時(shí)記錄相應(yīng)的SPR信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，檢出限約為102PFU/mL。Lei等將微泵、微通道和SPR生物傳感器集成在一個(gè)PMMA芯片上(見(jiàn)圖6)，用SPR信號(hào)監(jiān)測(cè)芯片上RPMI-1640培養(yǎng)基中鼠L929細(xì)胞在胰酶加入前后的細(xì)胞粘附與脫附過(guò)程，整個(gè)體系對(duì)于監(jiān)測(cè)細(xì)胞在藥物作用下活力的變化非常實(shí)用，而且是研究溶液體系的變化對(duì)特定生物分子間相互作用影響的有效平臺(tái)。

SPR檢測(cè)另外一個(gè)特點(diǎn)是可以檢測(cè)溶液中可被捕獲或是沉積在界面表面上的分子及細(xì)胞，因而無(wú)需分離純化溶液中的特異分析物。Kim等在微芯片上集可表達(dá)GST-GFP(谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶綠色熒光蛋白)的E．Coli細(xì)胞培養(yǎng)、溶膜、及GST-GFP-谷胱甘肽酰金表面親和純化及SPR圖像檢測(cè)于一體，可在芯片上直接進(jìn)行SPR檢測(cè)，省去了GST-GFP的純化步驟，整個(gè)檢測(cè)敏感而且特異。類似地，Yang等在微流道中快速定量分析唾液中皮升級(jí)的IL-8，依照其含量輔助診斷口腔癌細(xì)胞的存在，對(duì)唾液中IL-8的檢出限為184pmol/L。另外SPR只檢測(cè)與抗體結(jié)合的細(xì)胞，溶液中的細(xì)胞并不被檢測(cè)到，故適用于細(xì)胞在自然狀態(tài)下與表面相互作用的研究。Suraniti等用一個(gè)SPR抗體微陣列金薄層芯片選擇性地檢測(cè)血液中的淋巴細(xì)胞。在芯片表面固定吡咯偶聯(lián)的抗體，然后檢測(cè)流經(jīng)的血液樣品，采集不同細(xì)胞加入時(shí)陣列中抗體反射率的變化曲線和SPR圖像而實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)抗體對(duì)應(yīng)淋巴細(xì)胞的存在和數(shù)量。這個(gè)系統(tǒng)適用于細(xì)胞粘附動(dòng)力學(xué)的研究及小型診斷系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)應(yīng)用。

圖6微流控SPR生物傳感器

此外在微流控芯片上運(yùn)用陣列的方式可以同時(shí)進(jìn)行對(duì)照及平行樣實(shí)驗(yàn)，在提高檢測(cè)通量的同時(shí)增加數(shù)據(jù)的質(zhì)量，因?yàn)樾酒蟽?nèi)部對(duì)照的設(shè)計(jì)可以校正反應(yīng)中非特異性結(jié)合及儀器漂變。Taylor等用前后十字交叉的方法制備3×3微陣列，并在其表面組裝液體栓雙層陣列進(jìn)行可尋址生物傳感，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)不同蛋白質(zhì)的活力，整個(gè)分析檢測(cè)步驟都由SPR實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)便于對(duì)問(wèn)題的發(fā)現(xiàn)及對(duì)反應(yīng)過(guò)程條件的優(yōu)化。

SPR檢測(cè)結(jié)合免疫學(xué)方法可以實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記監(jiān)測(cè)細(xì)胞及其代謝物分子的變化，良好的表面反應(yīng)特性結(jié)合高特異的免疫學(xué)反應(yīng)，是微系統(tǒng)上細(xì)胞研究的良好平臺(tái)，芯片的制作要求較高，檢測(cè)需要對(duì)微流道表面鍍金膜或是與有金膜的芯片相結(jié)合，但是可以用于長(zhǎng)時(shí)間的監(jiān)測(cè)。

7.總結(jié)與展望

微流控芯片的光學(xué)檢測(cè)方法多樣，而且一個(gè)芯片上可以集成多種檢測(cè)輔助手段，利用微流控芯片對(duì)細(xì)胞的操縱如流體切應(yīng)力作用、液滴化處理，再結(jié)合使用光學(xué)鑷子、納米技術(shù)、表面處理等手段往往可以使檢測(cè)更加靈敏和簡(jiǎn)便;此外多種檢測(cè)技術(shù)的結(jié)合應(yīng)用可以擴(kuò)展檢測(cè)的信號(hào)范圍和精度，顯示了微流控芯片檢測(cè)方法的多樣化和集成化。另外一個(gè)趨勢(shì)是向著小型化、便攜化發(fā)展，通過(guò)將光源、激發(fā)器、分析組件等檢測(cè)元件小型化，減小檢測(cè)的損耗和體積，發(fā)展出簡(jiǎn)易的現(xiàn)場(chǎng)、實(shí)時(shí)檢測(cè)分析系統(tǒng)，向著芯片實(shí)驗(yàn)室的方向發(fā)展。

微流控上細(xì)胞研究中光學(xué)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展使得細(xì)胞及生物分子的檢測(cè)進(jìn)入微米級(jí)、納米級(jí)及更小級(jí)別的檢測(cè)，對(duì)試劑的低耗、試樣的痕量、高精度分析使得微流控高通量檢測(cè)更加成熟，為生物微納系統(tǒng)的發(fā)展起著重要的促進(jìn)作用。但現(xiàn)有檢測(cè)方法對(duì)活細(xì)胞不同生命周期無(wú)創(chuàng)、實(shí)時(shí)、多成分的動(dòng)態(tài)信息檢測(cè)和傳感仍有很大挑戰(zhàn)，新的檢測(cè)思路和方法仍需發(fā)展，同時(shí)芯片上細(xì)胞檢測(cè)及傳感應(yīng)當(dāng)越簡(jiǎn)單實(shí)用越好，最好用圖像及顏色信息就可以分析。如僅僅采用CCD或是微流控光學(xué)微鏡(OFM)就可以完成信號(hào)采集，這樣利于對(duì)細(xì)胞的無(wú)損檢測(cè)及系統(tǒng)的小型化和便攜化，也更便于現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)檢測(cè)。微流控芯片上微陣列、新敏感材料如卟啉、特異探針和形狀記憶聚合物等的應(yīng)用將為微流控系統(tǒng)上細(xì)胞檢測(cè)提供有益的思路和借鑒。另外小型化設(shè)備及微電子系統(tǒng)如小型二極管激光器、LED、光纖及ARM嵌入式系統(tǒng)的應(yīng)用將使檢測(cè)系統(tǒng)的成本更低廉，更便于使用。

文獻(xiàn)鏈接：DOI:10．3724/SP．J．1096．2010．01357

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