利用微流控技術(shù)進(jìn)行主動式細(xì)胞分選的方法是在微流控裝置上通過采集不同細(xì)胞所帶有的特征信號,借助外力進(jìn)行分選。

1.熒光激活細(xì)胞分類術(shù)分選法

熒光激活細(xì)胞分類術(shù)(fluorescence-activatedcellsorter,FACS)或流式細(xì)胞分析術(shù)由于其本身具有的靈敏度高、高通量、技術(shù)發(fā)展成熟等特點已經(jīng)成為許多生物學(xué)家進(jìn)行細(xì)胞分選的首選方法。FACS的原理是通過壓力驅(qū)動和鞘液夾流等技術(shù)實現(xiàn)樣品聚焦,使經(jīng)特異性熒光染色的目標(biāo)細(xì)胞所制成的單細(xì)胞懸液呈單粒子排列,進(jìn)入檢測區(qū)域,檢測器按照其產(chǎn)生的散射光和激發(fā)熒光信號的不同進(jìn)行識別與記錄,進(jìn)而據(jù)其特性施以外力操控,實現(xiàn)細(xì)胞分選[4]。通常,由帶有熒光分子標(biāo)記的特異性抗體來對細(xì)胞表面的標(biāo)記物進(jìn)行識別。自從Fu等[5]將FACS與微流控設(shè)備結(jié)合,用于分選細(xì)胞以來,各種驅(qū)動力與微流控–流式細(xì)胞儀的組合應(yīng)運(yùn)而生,包括流體力驅(qū)動[6]、電滲力驅(qū)動[7]、靜電力驅(qū)動[8]、動電力驅(qū)動[9]、介電電泳驅(qū)動[10]等。Krivacic等[11]運(yùn)用該技術(shù),在微流控芯片上以3×104/s細(xì)胞的高速實現(xiàn)了對癌細(xì)胞高純度分選。Cho等[12]也使用微流控–流式細(xì)胞儀成功實現(xiàn)了對人類哺乳動物細(xì)胞的高純度富集與分選,富集濃度達(dá)到230倍。

在微流控芯片上運(yùn)用FACS完成細(xì)胞分選的優(yōu)勢:(1)靈敏性高,能夠在單個細(xì)胞水平上實現(xiàn)細(xì)胞的逐一分離;(2)精準(zhǔn)度高,細(xì)胞逐個通過檢測器后被精確分類而得以分選;(3)應(yīng)用廣泛,涉及的被分類物質(zhì)種類廣泛,可用于多種細(xì)胞的分選。但其缺陷在于:設(shè)備昂貴,微通道易阻塞,樣品易污染,分離的連續(xù)性無法保證,在檢測、分離過程中細(xì)胞受到的撞擊力大,導(dǎo)致細(xì)胞最終的存活率不高。這些缺陷有待進(jìn)一步研究與改善。

2.磁操控分選法

在微流控芯片上運(yùn)用磁操控分選法進(jìn)行細(xì)胞分選篩選簡便易行,易于作為前處理部分集成再用于細(xì)胞分析的微流控芯片上。磁操控分選法的高特異性與高效性使其在細(xì)胞分選方面具有相當(dāng)大的優(yōu)勢。免疫磁分選技術(shù)和高梯度磁分選技術(shù)是目前微流控芯片磁操控細(xì)胞分選主要應(yīng)用的方法。

免疫磁分選技術(shù)

該技術(shù)中細(xì)胞的分選是基于目的細(xì)胞表面的獨(dú)特抗原與免疫磁性微球(或免疫磁珠)上的特異性抗體通過抗原抗體反應(yīng)結(jié)合,在外加磁場作用下,僅與免疫磁珠結(jié)合的目的細(xì)胞被滯留在磁場中,無法與免疫磁珠結(jié)合的成分則被濾去,從而達(dá)到分離靶細(xì)胞的目的。在微流控芯片上利用免疫磁分選技術(shù)所分離出的目的細(xì)胞可直接用于后續(xù)的分析與檢測,從而簡化了操作步驟,提高了效率,便于連續(xù)化、集成化、自動化的實現(xiàn)。Kim等[13]利用C2A蛋白標(biāo)記的磁珠,在微流控芯片上運(yùn)用免疫磁分選技術(shù),成功地使細(xì)胞懸液中的Jurkat凋亡細(xì)胞獲得高效分離。Forbes等[14]在微流控裝置上運(yùn)用免疫磁分選技術(shù),實現(xiàn)了對磁標(biāo)記乳腺癌mcf7細(xì)胞的高純度分離,大大提高了臨床診斷的準(zhǔn)確性。

高梯度磁分選技術(shù)

20世紀(jì)60年代后期開始發(fā)展起來的高梯度磁分選技術(shù)(highgradient magneticseparation,HGMS),主要用于分離磁性極弱的微粒,例如直徑在100nm以內(nèi)的順磁性或逆磁性微粒。高梯度磁分選系統(tǒng)通常由填充有易磁化超細(xì)金屬絲的柱形過濾器和電磁場組成,金屬絲在電磁場的作用下產(chǎn)生磁場梯度,使處于該區(qū)域的己被磁化了的目的微粒被梯度磁力吸引而固定,而樣品中的其他非磁性成分則不會在該區(qū)域滯留,從而實現(xiàn)目的微粒的分選。Adams等[15]制作了一個微流控芯片連續(xù)高梯度磁泳分選器,運(yùn)用高梯度磁分選技術(shù)實現(xiàn)了對目標(biāo)細(xì)胞的的連續(xù)快速高純度分離。夏恒[16]利用相關(guān)軟件,通過仿真模擬,將微通道的構(gòu)型做了優(yōu)化與改進(jìn),在微流控裝置上實現(xiàn)了磁泳連續(xù)高效細(xì)胞分選。

微流控芯片上的磁操控分選法具有如下優(yōu)勢:(1)分選速度快、效率高、重復(fù)性好;(2)操作簡單、無需昂貴的儀器設(shè)備,便于實現(xiàn)高通量、自動化;(3)分離過程無毒無污染,并可同時產(chǎn)生富集、純化效果;(4)被分離細(xì)胞的存活率高,且生物學(xué)性狀與功能不受影響。但是,目的細(xì)胞上獨(dú)特抗原的特異性抗體的篩選是該技術(shù)的重點與難點,是制約該技術(shù)推廣使用的瓶頸。

3.雙向電泳分選法

雙向電泳(dielectrophoresis,DEP),又稱介電電泳,是微流控芯片上較常采用的細(xì)胞分選法,該方法利用芯片上的交流電場將樣品溶液中的目的細(xì)胞分離,可利用細(xì)胞大小不同,同時完成對細(xì)胞的濃縮、操控和分選,是一種高效率且高選擇性的方法。其原理是細(xì)胞在高頻電場作用下產(chǎn)生極化,因介電特性、電導(dǎo)率和形狀不同,不同種類細(xì)胞感應(yīng)出不同的偶電極,從而受到不同的介電力,致使它們以不同速率向電場的正極或負(fù)極定向移動,從而在電場中實現(xiàn)分離。Gascoyne等[17]使用雙向電泳–場流分級(dielectrophoresis-field-flow-fractionation,DEP-FFF)技術(shù)成功的從患者血液中分離出了感染瘧原蟲后的病態(tài)紅細(xì)胞。由于紅細(xì)胞感染瘧原蟲后,細(xì)胞膜表面蛋白發(fā)生改變,因此病態(tài)細(xì)胞等電點與正常細(xì)胞存在差異,在正旋交流電的作用下,病態(tài)紅細(xì)胞以異常的泳動速度在微通道分離腔中實現(xiàn)分選。Zhu等[18]采用雙向電泳技術(shù),在微流控芯片上實現(xiàn)了對直徑在4~8μm的酵母細(xì)胞的連續(xù)高效分選。

在微流控芯片上利用雙向電泳技術(shù)可對細(xì)胞直接進(jìn)行無接觸的選擇性操控、定位與分選,無需特異性細(xì)胞標(biāo)記或修飾,外圍設(shè)備簡單,操作簡便。但是生物細(xì)胞在電場中存活率較低,且該方法特異性較差,對于介電特性、電導(dǎo)率、形狀等性質(zhì)相似的細(xì)胞無法實現(xiàn)精確分離。

4.光學(xué)鑷子分選法

在微流控裝置上運(yùn)用光學(xué)鑷子分選法操控細(xì)胞分離時,由于光獨(dú)特的光學(xué)極化效應(yīng),無需接觸待分離的細(xì)胞,因而避免了機(jī)械接觸所造成的污染與損傷,大大提高了分選后細(xì)胞的存活率,該技術(shù)已受到越來越多研究者的關(guān)注。光學(xué)鑷子分選法主要根據(jù)目的細(xì)胞的大小和折射指數(shù),在光干涉測量模式下,激光聚集可形成光阱,微小物體受光壓而被束縛在光阱處,移動光束使微小物體隨光阱移動,借此可對目的細(xì)胞進(jìn)行捕獲與分選[19]。捕獲束的控制位置位于兩個單纖維之間的微球上,微球的位置決定兩纖維間的耦合程度,并決定光在二者間是聚焦還是偏斜,進(jìn)而將產(chǎn)生的光信號與微通道內(nèi)的電解質(zhì)顆粒偶聯(lián),最終通過電場梯度截獲電解質(zhì)顆粒而捕獲靶細(xì)胞。Wang等[20]利用光學(xué)鑷子分選技術(shù),在微流控芯片上分別實現(xiàn)了對酵母細(xì)胞和人類胚胎干細(xì)胞的操控與分離。

雖然,該技術(shù)的效率與FACS等相比仍較低,但其優(yōu)勢在于靈敏度極高,即使細(xì)胞間相互作用后產(chǎn)生的形變極其微小也可改變光的狀態(tài),進(jìn)而通過光信號實現(xiàn)細(xì)胞分選。Chiou等[21]對細(xì)胞間相互作用及聚焦激光束進(jìn)行深入研究后,對微流控裝置加以改進(jìn),從而實現(xiàn)了高通量進(jìn)樣,大大提高了分選效率。

5.超聲波分選法

利用超聲波輻射力對懸液中的粒子進(jìn)行分離提取,已被廣泛應(yīng)用于傳統(tǒng)的化學(xué)工程與材料科學(xué)領(lǐng)域。超聲波分選技術(shù)是利用超聲波輻射力所具有的空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)、熱效應(yīng),以及超聲空化過程中氣泡的劇烈變化所產(chǎn)生的附加湍動效應(yīng)、界面效應(yīng)、聚能效應(yīng)等,通過提高傳質(zhì)系數(shù),增大介質(zhì)分子的運(yùn)動速度,增強(qiáng)介質(zhì)的穿透力以強(qiáng)化分離過程[22]。由壓電材料在微通道中引發(fā)的超聲共振效應(yīng)可以產(chǎn)生超聲波輻射力,從而產(chǎn)生上述效應(yīng),當(dāng)細(xì)胞以流體的形式在微通道內(nèi)移動時,不同直徑、密度、可壓縮性的細(xì)胞在上述多種效應(yīng)的作用下,會產(chǎn)生不同的遷移率,進(jìn)而可根據(jù)通過檢測窗的先后順序,完成細(xì)胞在微流控芯片上的分選。Petersson等[23]利用該原理,在微流控芯片上以自由流體聲波電泳的方式,完成了對直徑在2~10μm之間的粒子的分選,并將該技術(shù)應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,實現(xiàn)了對血液中紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板的連續(xù)高效分選。該技術(shù)在應(yīng)用過程中,細(xì)胞于超聲波輻射力的作用下能否存活成為許多研究者關(guān)注的問題。Evander等[24]研究了細(xì)胞在超聲共振效應(yīng)中所受到的力以及微通道中溫度升高的幅度,實現(xiàn)了對神經(jīng)干細(xì)胞的高存活率分離,得到的目的細(xì)胞在微通道中可以存活十五分鐘以上。

該技術(shù)分選效率較高,無需復(fù)雜的大型設(shè)備,但對設(shè)備材質(zhì)的要求較高,價格昂貴,對操作人員的專業(yè)素質(zhì)要求也較為苛刻,不利于推廣使用。