微流控芯片作為微型化液體環(huán)境的細胞培養(yǎng)裝置，具有穩(wěn)定的技術(shù)及其功能，近年來在 生物工程、生物醫(yī)藥、醫(yī)療檢測領(lǐng)域有著很好的延伸前景，每種領(lǐng)域里都有相應(yīng)的微流控芯片類型，衍生出了較多種類的微流控芯片。同時，每種不同材料的微流控芯片都具有其相應(yīng)的材料特性，也有不同的檢驗檢測方法。iGEM 是來自麻省理工大學的世界性合成生物學競賽，比賽倡導(dǎo)通過合理的合成生物學改造來解決實際遇到的問題。2017 年是 iGEM_BIT 隊與 XMU-CHINA 合作的第一年，本文主要介紹了兩隊的微流控芯片制作、檢測方法以及實驗成果展示。

在 10~100μm 寬的溝道系統(tǒng)中對流體或氣體進行操控的技術(shù)被稱為微流控技術(shù)，以微流控技術(shù)為核心、通過 MEMS技術(shù)加工出的應(yīng)用于生物、化學、生物醫(yī)學等領(lǐng)域的芯片型微全分析系統(tǒng)被稱為微流控芯片。20 世紀 90 年代中后期，隨著微制作技術(shù)的發(fā)展，微流控芯片研究經(jīng)歷了一個迅速發(fā)展的時期，制作技術(shù)也日臻完善，各種基于微流控芯片的單元操作技術(shù)也層出不窮。進入到 21 世紀初后期，大規(guī)模集成成為微流控芯片的發(fā)展潮流。目前微流控芯片已經(jīng)成為發(fā)展最為迅猛的分析研究技術(shù)。

目前常見微流控芯片主要有三個種類：單晶硅片、石英和玻璃、高分子聚合物。

最早的微流控芯片是用單晶硅制作。這主要得益于成熟的微電子和微機械加工技術(shù)。玻 璃微流控芯片具備優(yōu)良的光學性能和支持電滲流特性，易于表面改性，可直接借鑒傳統(tǒng)的毛 細管電泳分析技術(shù)，因此在微流控芯片發(fā)展初期受到更多重視并得到相應(yīng)發(fā)展，至今仍是最 廣泛使用的芯片之一。用玻璃材料制作微流控芯片具有很多的優(yōu)越性，但聚合物以其較玻璃 價廉，制作方法簡單，生產(chǎn)成本低，可制作一次性使用芯片等特點，正日益為人們所關(guān)注。

為了實現(xiàn) 2017iGEM_BIT 隊伍生物部分的工業(yè)大規(guī)?；a(chǎn)，iGEM_BIT 隊伍自主設(shè)計研 發(fā)了微流控芯片。 微流控芯片為整套生物學檢測方法提供了兩個反應(yīng)腔室，兩個腔室分別是用于磁珠適配體的檢測和工程菌的熒光表達。通過真空凍干法將適配體和工程菌菌液預(yù)先分步凍干于芯片內(nèi)，將使得芯片的快速檢測程度得到很大的提升。此外，設(shè)計的儀器采用了 同時能檢測紅光和綠光的共聚焦式光學通路（光學器件來自于公司名），有效的降低了光學 儀器占用的空間，又不影響光學檢測精度。儀器中配套微流控芯片負壓法注樣而使用的蠕動泵，最低泵速為 6ul/min，在 39ul/min 時達到最好精度 （±2%）。

在項目研發(fā)過程中，我們設(shè)置并進行了以下的實驗：

1、 微流控芯片及芯片外工程菌的生長曲線測定

2、 微流控芯片及芯片外含阿拉伯糖誘導(dǎo)型啟動子的工程菌在阿拉伯糖誘導(dǎo)下報告基因的 表達情況（芯片外測試涉及到無氧情況的影響）

3、 微流控芯片內(nèi)磁珠適配體凍干實驗（包括芯片外凍干及與甲胎蛋白反應(yīng)情況）

4、 微流控芯片的光學檢測（定性）

5、 微流控芯片的熱學檢測（定量）

6、 光學儀器的模擬

實驗展示：

一、 微流控芯片及芯片外工程菌的生長曲線測定

實驗?zāi)康模罕碚骷毦谛酒系纳L情況，評估芯片的細菌培養(yǎng)能力

設(shè)計思路：通過 OD 值與熒光強度來表征細菌的生長狀況并通過與芯片外（培養(yǎng)試管內(nèi)）細 菌生長情況對比反映芯片的細菌培養(yǎng)能力。用于測定這兩個參數(shù)的酶標儀不支持對芯片的直 接檢測，因此需設(shè)法將芯片內(nèi)菌液排出?？紤]到芯片內(nèi)菌液的體積定量問題與余液問題，我 們采用了排出液體——定量取液——稀釋的方法從芯片內(nèi)取出菌液置于 96 孔板上進行檢測。

實驗設(shè)計：變量設(shè)計：時間（每 2 小時測定一次）

對照設(shè)計：細菌生長場所：芯片內(nèi)與培養(yǎng)試管內(nèi)

結(jié)果指標：由測量結(jié)果繪制的 OD-時間曲線與熒光強度-時間曲線

實驗材料：7ml LB 無抗培養(yǎng)基、無菌水、氯酶抗生素（與菌種抗性有關(guān)）、負二十攝氏度 甘油保藏的菌種、注射器、微流控芯片（使用直徑 12mm 圓形培養(yǎng)腔，腔室高度 0.4mm， 準備數(shù)量由預(yù)計測量時間與測量間隔決定）、96 孔板、1.5ml 離心管（每次檢測 2 個）

實驗步驟：

①：芯片預(yù)處理

使用注射器以 100μl/min 的流速分別注入 5ml 無水乙醇和 3ml PBS 緩沖液，隔夜晾干。

注意：

①：芯片的預(yù)處理對于芯片培養(yǎng)細菌的能力有很大影響

②：乙醇可沖洗掉未完全固化的光膠

③：PBS 的作用在于沖洗掉殘留乙醇并對芯片腔室表面進行處理，利于細菌生存

②：隔夜復(fù)蘇菌種 J-D-P(plux-RBS-LuxR-RBS-Luxl-RBS-LacI-RBS-GFP-T)（可表達 GFP） 7ml 無抗培養(yǎng)基加入 3‰的氯酶（21μl）和 100μl 負二十攝氏度甘油保藏的菌種，在 37℃ 搖床隔夜培養(yǎng)。

③：轉(zhuǎn)接菌種

7ml 無抗培養(yǎng)基加入 3‰的氯酶（21μl）和 100μl 隔夜培養(yǎng)的菌液，在 37℃搖床培養(yǎng) 1h。

④：開始檢測，注入菌液

在培養(yǎng)試管中均勻取 100μl 菌液點樣在 96 孔板上，點三次樣，檢測 OD 值和熒光強度。 在培養(yǎng)試管中均勻取 100μl 菌液加入潔凈 1.5ml 離心管中，用注射器吸取菌液注入芯片， 將芯片置于槍頭盒內(nèi)，放入 37℃搖床培養(yǎng)。

注意：由于實驗過程中未使用泵進行注射，因此此注射方式為手動注射，要求用力盡量均勻 并稍微傾斜芯片防止注射過程中產(chǎn)生氣泡

⑤：排出菌液檢測

兩個小時后，取出芯片，用注射器注入空氣，排出菌液至 1.5ml 潔凈離心管。從離心管與 培養(yǎng)試管中分別吸取 70μl 的菌液至另外一潔凈 1.5ml 離心管，另吸取 280μl 無菌水稀 釋菌液。再從稀釋的菌液中取 100μl 點樣于 96 孔板上，各點三次樣，檢測 OD 值和熒光 強度。

注意：可傾斜芯片使液體順利排出

⑥：重復(fù)⑤每兩個小時測一次。

⑦：畫出 OD-時間曲線和熒光強度-時間曲線。

實驗結(jié)果：

圖 1 12 小時培養(yǎng)得到的大腸桿菌的 OD-時間曲線和熒光強度-時間曲線

結(jié)果分析：

由曲線可以看出，芯片內(nèi) OD 曲線在 8h 后有比較明顯的下滑，芯片內(nèi)的熒光強度在 4-12h 也呈下降趨勢，且芯片內(nèi)的 OD 值整體低于離心管內(nèi) OD 值。我們分析可能的原因在于：①： 芯片內(nèi)環(huán)境相對試管中較為狹窄，對細菌的代謝活動有一定影響。②：芯片透氣性不足，菌 群數(shù)量達到一定程度時面臨缺氧問題。

二、微流控芯片及芯片外含阿拉伯糖誘導(dǎo)型啟動子的工程菌在阿拉伯 糖誘導(dǎo)下報告基因的表達情況（芯片外測試涉及到無氧情況的影響）

模塊一：探究芯片內(nèi)缺氧環(huán)境對細菌生長表達的影響

實驗設(shè)計：由于之前在芯片中的細菌的培養(yǎng)實驗結(jié)果與離心管內(nèi)培養(yǎng)的結(jié)果相差較大，經(jīng)過 分析我們認為可能芯片內(nèi)的缺氧環(huán)境對細菌的生長和表達產(chǎn)生了影響。所以我們設(shè)計了芯片 外的模擬缺氧環(huán)境來探究這種影響。并且使用了受阿拉伯糖誘導(dǎo)表達的大腸桿菌作為菌株， 設(shè)置不同濃度的阿拉伯糖濃度（10g/L、5g/L、1g/L、0.1g/L、0.01g/L、0g/L）。

實驗材料：受阿拉伯糖誘導(dǎo)表達的大腸桿菌（pbad-RBS-LacI-RBS-GFP-T-plac-RBS-RFP-T）、 氨芐抗生素（AMP）、100mg/ml 的阿拉伯糖溶液、7ml 無抗 LB 液體培養(yǎng)基、無菌水、PCR 管、 1.5ml 離心管、96 孔板。

實驗步驟：

①加入材料，復(fù)蘇細菌

在 7ml 無抗 LB 培養(yǎng)基中分別加入 100μl 甘油保存的菌種、1‰的 AMP（7μl）， 再分別加入 0.7μl、7μl、70μl、350μl、700μl 的 100mg/ml 的阿拉伯糖溶 液。置于 37℃搖床培養(yǎng)復(fù)蘇 1h。

②分裝入 PCR 管和離心管

取出復(fù)蘇的菌，分別加入 100μl 吹勻菌液至 1.5ml 離心管（每一個梯度阿拉伯 糖各四管），250μl 吹勻菌液至 PCR 管（基本加滿，每一個梯度阿拉伯糖各四管）。 在放置板上放置好，置于 37℃搖床培養(yǎng)。另取 100μl 菌液在 96 孔板點樣，每 一個梯度點三次，檢測 OD 和熒光。

③稀釋檢測

每兩個小時取出每個濃度的 PCR 管和離心管，各取出 70μl 置于另一潔凈 1.5ml 離心管，稀釋 5 倍，取 100μl 菌液在 96 孔板點樣，各點三次，檢測 OD 和熒光。

④拷出數(shù)據(jù)，畫出生長表達曲線。

實驗結(jié)果：

圖 2 本次的阿拉伯糖的誘導(dǎo)試驗:離心管和 PCR 管內(nèi)大腸桿菌的生長曲線和熒光曲線 圖 3 以前的阿拉伯糖的誘導(dǎo)實驗：96 孔板內(nèi)大腸桿菌的熒光曲線

實驗結(jié)果表明缺氧環(huán)境下細菌的生長和表達都用一定的下降，這的確是在芯片內(nèi)培養(yǎng)菌 和在外界培養(yǎng)的一個較大不同，關(guān)于阿拉伯糖濃度對大腸桿菌誘導(dǎo)，對比之前所作實驗（探 究阿拉伯糖對工程菌的熒光表達的影響）可以發(fā)現(xiàn)阿拉伯糖的誘導(dǎo)并非濃度越高越有效。

一、 微流控芯片內(nèi)磁珠適配體凍干實驗（包括芯片外凍干及與甲胎蛋 白反應(yīng)情況）

微流控芯片的光學檢測（定性）

實驗?zāi)康模翰榭葱酒墓鈱W分布

實驗設(shè)備：3 個芯片中的 6 個腔室、一支 1mL 注射器、4 個離心管。

實驗材料：熒光微球蛋白溶液、熒光素鈉溶液

實驗步驟：實驗分為兩個部分：一、定性部分 二、定量部分

定性部分

1、先將熒光相比熒光素鈉較強的熒光微球蛋白 50uL 溶液注入芯片。

2、芯片在注射過程中保持傾斜 30°角，實驗人在注入過程中盡量保持注射過程 緩慢而勻速。

3、為了做比對，選擇將濃度不變的熒光微球直接滴加到載玻片上，觀察熒光分 布。

4、在原載玻片上蓋上蓋玻片，再觀察熒光分布。

定量分布

1、稱取 0.3763g 的熒光素鈉加入到 10mL 的蒸餾水中，配成 0.1mol/L 的熒光素 鈉溶液。

2、將 0.1mol/L 的熒光素鈉溶液分別稀釋 7000 倍、10000 倍、20000 倍分別得到 熒光素鈉溶液①、②、③。

3、各抽取熒光素鈉溶液①、②、③100uL 加入到 96 孔板中進行熒光值的測量（增 益選 50）。 3、將熒光素鈉溶液①、②、③分別加入到芯片中，觀察熒光分布。

實驗結(jié)果：

表 3 熒光素鈉溶液的熒光值

實驗結(jié)論：

一、首先比較了圖一、圖二我們發(fā)現(xiàn)我們的芯片透光性很好，在芯片內(nèi)和在載玻片上的熒光 是差不多的。

二、通過圖 3，即蓋上了蓋玻片以后，我們發(fā)現(xiàn)熒光強度大大減小，本來為了做對比，應(yīng)該 找一個能裝 50uL 的槽蓋上載玻片進行觀察?？墒怯捎跅l件較為嚴苛，未能實驗，但是我們 結(jié)合第一個結(jié)論，依然可以得出光膠并未太多的影響光的分布

三、通過圖 4、圖 5、圖 6，我們可以發(fā)現(xiàn)芯片的透光性還是可以的。結(jié)合圖 7 我們的熒光 測量，則定量的說明了我們芯片的透光性良好

四、微流控芯片的熱學檢測（定性/量）

光學儀器的模擬

實驗?zāi)康模候炞C我們設(shè)計的檢測光路，根據(jù)驗證結(jié)果優(yōu)化光路

設(shè)計思路：使用實際元件進行光路驗證存在諸多不便：首先光學元件價格較高，盲目進行實 驗可能造成不必要損失，其次，根據(jù)驗證結(jié)果不斷調(diào)整元件位置的過程較為費時費力。為了 避免時間與金錢的浪費，我們采用光學仿真的方法來為我們后續(xù)的光路搭建提供指導(dǎo)與參考。

實驗設(shè)計：利用 Zemax 軟件，根據(jù) thorlabs 網(wǎng)站上提供的元件參數(shù)進行模擬光路搭建過程， 并通過在軟件中查看檢測面的光圈分布評判我們光路的效果，并以此為根據(jù)對我們的光路進 行改良。

使用元件：平凸透鏡（2 個）型號：LA1304，焦距：4mm，曲率半徑：20.6mm 二向色鏡（實際仿真過程中表現(xiàn)為反射面）

實驗過程：

圖 13 光學仿真使用的 ZEMAX 界面

圖 14 光學仿真中的光路圖

仿真過程主要出現(xiàn)了兩個問題：

1、光圈過小

解決方法：光圈過小，最先想到的是兩個方面：一、透鏡折射率過大，二、檢測面與二色鏡 靠的太近，所以最直接的是將檢測面的 Y 值（即縱坐標值）由 30 變?yōu)?40. 此時出現(xiàn)了第二個問題

2、光圈太暗

解決方法：從上圖中我們發(fā)現(xiàn)光的發(fā)散角過大，導(dǎo)致很多光都照到了管壁，所以減小發(fā)散角 或增加光闌即可，于是得到最終結(jié)果。

圖 15 光學仿真中遇到的問題

圖 16 偵測器結(jié)果

從圖 2 我們可以得知光路仿真結(jié)果較好，光的分布較為均勻，光的強度較弱，是因為光源選 的功率只有 1W，簡單地增加光源強度即可，此處不再贅述。

結(jié)論：

我們選用的 LA1304 透鏡符合我們的基本要求，達到我們較為理想的結(jié)果，仿真成功。