組織活檢是目前癌癥診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但是具有創(chuàng)傷性且多次活檢患者依從性差，而液體活檢無創(chuàng)且可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)成為了檢驗(yàn)科新的趨勢(shì)。那么什么是液體活檢？其是指循環(huán)腫瘤細(xì)胞，循環(huán)腫瘤DNA和外泌體。通過非侵入性的取樣方法獲得腫瘤細(xì)胞信息，輔助腫瘤治療的突破性檢測(cè)技術(shù)。而本文重點(diǎn)介紹當(dāng)前熱門的CTCs和ctDNA檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)展。 

1. CTCs檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)展

1869年，Ashworth首次提出循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）——原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶脫落進(jìn)入外周血的腫瘤細(xì)胞，其包含有原發(fā)性腫瘤的遺傳信息和表型。

       CTCs在血液中的含量極少，因此對(duì)其進(jìn)行研究時(shí)必須先進(jìn)行富集。富集方法主要包括梯度離心法、過濾法和免疫磁性分選法。檢測(cè)方法包括免疫學(xué)技術(shù)、反轉(zhuǎn)錄聚合酶連鎖反應(yīng)技術(shù)、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)以及CTC 芯片技術(shù)。

圖1. CellSearch 檢測(cè)CTCs代表性例子的結(jié)果示意圖

其中免疫磁性分選法是當(dāng)前最常用的一種CTC富集方法。而強(qiáng)生公司研發(fā)的專有技術(shù)CellSearch檢測(cè)系統(tǒng)（圖1）已經(jīng)成為CTC檢測(cè)的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方案，特異度達(dá)到80%。通過上皮細(xì)胞黏附因子標(biāo)記的抗體磁珠來捕獲CTC，然后細(xì)胞內(nèi)角質(zhì)蛋白熒光抗體(CKPE)可以識(shí)別上皮細(xì)胞，白細(xì)胞熒光抗體(CD45-APC)能夠識(shí)別白細(xì)胞以及4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)，熒光核染料用于生成顯微鏡下可視細(xì)胞圖像。其中符合腫瘤細(xì)胞學(xué)形態(tài)特征而同時(shí)CKPE (+)、DAPI (+) 和CD45(－)的細(xì)胞被定義為CTC。該方法只需要7.5ml血液樣本，即可從幾百億血液細(xì)胞中檢測(cè)到一個(gè)CTC。 CellSearch 檢測(cè)系統(tǒng)目前也已經(jīng)被FDA批準(zhǔn)進(jìn)入臨床應(yīng)用。

2.ctDNA檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)展

1940年Mandel和Metais首次提出了細(xì)胞外游離核酸（ctDNA），其主要來源于凋亡或壞死的腫瘤細(xì)胞的DNA片段，隨著人體血液循環(huán)系統(tǒng)不斷的流動(dòng)，并攜帶有基因突變、缺失、重排、拷貝數(shù)異常和甲基化等信息。但是ctDNA在腫瘤患者體內(nèi)的含量很低，約占整體cfDNA 的1%，半衰期短，約為２ｈ。因此需要靈敏度高的檢測(cè)技術(shù)。

       ctDNA 檢測(cè)技術(shù)可分為兩個(gè)階段。第一階段為基于PCR 技術(shù)的檢測(cè)技術(shù)，如突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)(ARMS) 法、直接測(cè)序法( Sanger法)、微滴數(shù)字化PCR(dPCR) 等。第二階段為在NGS 基礎(chǔ)上發(fā)展起來的檢測(cè)方法。

圖2. ARMS法

ARMS法(圖2)的原理是PCR引物的3'端末位堿基必須與其模板DNA互補(bǔ)才能進(jìn)行擴(kuò)增，需要設(shè)計(jì)等位基因特異性PCR擴(kuò)增引物，只有在引物3'堿基與模板配對(duì)時(shí)才能出現(xiàn)PCR擴(kuò)增帶，從而檢測(cè)出目的基因是否突變。以提取到的ctDNA作為模板可用于檢測(cè)是否發(fā)生特定的基因突變。例如，用人類EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒檢測(cè)EGFR基因是否發(fā)生突變。當(dāng)EGFR基因?yàn)橐吧蜁r(shí)，一般情況下無法延伸，只有當(dāng)EGFR基因發(fā)生突變時(shí)引物可與模板完全匹配，隨即發(fā)生相應(yīng)的擴(kuò)增。若EGFR基因未發(fā)生突變則無擴(kuò)增。

數(shù)字PCR (dPCR)(圖3)是將一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)分配到大量微小的反應(yīng)器中，在每個(gè)反應(yīng)器中包含或不包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的目標(biāo)分子( ctDNA作為模板)，實(shí)現(xiàn)單個(gè)反應(yīng)器單條模板的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后，通過陽(yáng)性反應(yīng)器的數(shù)目計(jì)算目標(biāo)序列的拷貝數(shù)，是一種DNA定量的新技術(shù)。優(yōu)點(diǎn)是可以對(duì)ctDNA進(jìn)行絕對(duì)定量，靈敏度可達(dá)到單個(gè)核酸分子，檢測(cè)限低至0.001%，但缺點(diǎn)是只能檢測(cè)已知的突變位點(diǎn)且通量低。

二代測(cè)序法是利用測(cè)序儀器來捕捉新滲入的末端熒光標(biāo)記來確定DNA序列的組成，能一次并行對(duì)幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定。同樣可以將提取到的ctDNA用其進(jìn)行檢測(cè)。不僅可以檢測(cè)已知基因變異，更重要的是可以進(jìn)行全基因組范圍內(nèi)的基因變異分析，包括基因突變、重排以及基因組拷貝數(shù)變異(CNV)，并可以發(fā)現(xiàn)未知的基因變異。