作者：余韓潔鈺&周子琦

幾乎所有組織都是由多種類型的細胞和細胞外基質(zhì)（ECM）集成的3D結(jié)構(gòu)。組織功能的實現(xiàn)，需要細胞間信號傳導，以及細胞與周圍ECM相互作用。肝臟是由排列在3D支架原代肝細胞、肝星狀細胞、庫普弗細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞等組成的。

目前研究者們也用很多不同的方式構(gòu)建了3D肝模型，包括小型的多孔培養(yǎng)系統(tǒng)、3D細胞打印、3D細胞成型等。它大都是將肝細胞與其他細胞在微模式的3D支架中培養(yǎng)，當異型細胞之間足夠近時，會產(chǎn)生生化相互作用，它們之間相互協(xié)調(diào)，從而實現(xiàn)改善的肝特異性功能。但這些技術(shù)可能在均勻性、可移植性和數(shù)量方面受到一定限制。所以本文想要做能夠精確控制的3D結(jié)構(gòu)中的不同細胞組成的多功能人類微組織。

本文報道了通過在生物相容性的3D核-殼凝膠支架中控制異型細胞的組裝，如下圖所示，基于微流控技術(shù)來產(chǎn)生高度單分散的結(jié)構(gòu)，在液滴中創(chuàng)建人造肝臟。研究者制造水-水-油（w / w / o）雙重乳液，并將其用作模板，成功地將3D核-殼支架與肝細胞整合到殼中的成纖維細胞包圍的核心中。

圖1 原理圖

如圖2b和2c所示，微流控芯片的內(nèi)相是細胞培養(yǎng)基，中相是藻酸鹽水溶液，其中有Ca-EDTA復合物，由于雷諾數(shù)低，內(nèi)相與中相共流，在交匯處由于氟化碳油，形成單分散的由水性核心和水凝膠殼組成的液滴。下游引入了一種額外的油流，該油流包含0.15％的乙酸，并觸發(fā)藻酸鹽溶液中Ca 2+從Ca-EDTA復合物中釋放出來；隨后，二價Ca 2+與藻酸鹽鏈的兩個不同羧基結(jié)合，形成交聯(lián)的3D網(wǎng)絡，如圖2a。文中還通過用熒光素標記藻酸鹽，進行熒光共聚焦顯微鏡觀察，得出單分散核-殼液滴的直徑為169±6μm。

圖2 a) 通過觸發(fā)Ca2+從Ca-EDTA復合物中釋放而使藻酸鹽網(wǎng)絡交聯(lián)。b)PDMS設備的示意圖。c) 使用w / w / o雙乳液作為模板制備核-殼液滴。d) 使用基于液滴的微流體產(chǎn)生的單分散核-殼液滴。

為了將肝細胞組裝在核心中，將肝細胞預混在內(nèi)相的培養(yǎng)基中，其被凝膠殼包裹在核心中，經(jīng)過幾天的培養(yǎng)開始出現(xiàn)聚集體，如圖3a所示。同樣的，當把成纖維細胞預混在海藻酸鹽溶液的中間相時，其就被海藻酸鹽網(wǎng)絡限制在殼中，并且在核中沒有觀察到細胞，如圖3b所示。為了模擬人類肝臟3D結(jié)構(gòu)，將肝癌細胞HepG2組裝在被成纖維細胞NIH-3T3包圍的核心中。該研究中，通過殼中藻酸鹽的原位交聯(lián)形成球體，并將球體快速轉(zhuǎn)移到細胞培養(yǎng)基中，把細胞暴露于弱酸性條件是有限的，并且對細胞活力幾乎沒有影響。如圖3c多為活細胞（綠色），幾乎沒有死細胞（紅色）。   

圖3 3D核-殼支架中不同細胞的空間組裝a) 凝膠殼將HepG2細胞限制在核心中。b)通過交聯(lián)的藻酸鹽網(wǎng)絡固定在殼中的NIH-3T3成纖維細胞。c) 肝細胞在核心中同時組裝，在殼中成纖維細胞同時組裝，形成一滴人造肝臟。（比例尺100μm，細胞活力通過鈣黃綠素AM /EthD-1染色試劑盒進行表征。）

如圖4，在37°C的培養(yǎng)基中培養(yǎng)核-殼球體，兩周后仍保持其球形，在此期間細胞變得更致密。將其凍干，在掃描電子顯微鏡下頁觀察到了明顯的球形。此外，冷凍干燥的球體的橫截面顯示出核心中的密集細胞聚集體和殼中的分散細胞。海藻酸鹽水凝膠的外殼堅固耐用，同時具有很高的滲透性，使營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物能夠通過。交聯(lián)海藻酸鹽的水凝膠殼在機械上是堅固的，將其存儲于-80°C下，依然能在37°C不破壞結(jié)構(gòu)或影響細胞活力的情況下再次培養(yǎng)。經(jīng)過10天的培養(yǎng)，細胞也基本都是活的，沒有死細胞出現(xiàn)（紅色）。14天后，細胞活力略有下降，作者解釋說，可能因為細胞增殖產(chǎn)生了高細胞密度，核心處有低氧狀況出現(xiàn)。

圖4 在核-殼球體中共培養(yǎng)肝細胞和成纖維細胞。a-c) 肝細胞在核心和殼中的成纖維細胞分別共培養(yǎng)1天，7天和14天。隨著時間的推移，保持其球形形態(tài)。d-e)SEM圖像。f) 在核-殼結(jié)構(gòu)中空間受限的細胞集合。g）在-80℃下凍兩周然后在37℃下融化之后，封裝在球狀體中的細胞的高存活力。h）封裝在球體中的細胞共培養(yǎng)10天顯示出高細胞活力。i）培養(yǎng)14天的細胞的活力略有下降。

為了在一滴中測量微組織的肝臟特異性功能，隨時間監(jiān)測其白蛋白分泌和尿素合成。白蛋白和尿素是肝臟的關鍵生物標志物。用相同數(shù)量的肝細胞培養(yǎng)了兩個樣品，一個在核-殼結(jié)構(gòu)中，殼中有成纖維細胞，另一個沒有成纖維細胞，并分別使用白蛋白和尿素檢測試劑盒監(jiān)測培養(yǎng)基中白蛋白和尿素的濃度。相比肝細胞的單型培養(yǎng)單獨，肝細胞和成纖維細胞的共培養(yǎng)的核殼球狀體的白分泌和尿素合成都增加了，表明3D微型共培養(yǎng)與傳統(tǒng)的單型細胞培養(yǎng)相比，有了顯著增強的肝臟特異性功能。

圖5 肝細胞/成纖維細胞共培養(yǎng)和肝細胞培養(yǎng)的肝臟特異性功能的測定。在七天內(nèi)測量的HepG2 / NIH-3T3共培養(yǎng)和HepG2培養(yǎng)的a)白蛋白分泌和b）尿素合成。

總之，本文使用基于液滴的微流控技術(shù)，將肝細胞和成纖維細胞分層組裝成3D核-殼支架，在每個液滴中形成人造肝臟。并表明嵌入3D核-殼支架中的肝細胞和成纖維細胞的共培養(yǎng)是體外肝臟的良好模型。具有同型和異型細胞間相互作用的平衡，有利于其表達肝臟的特定功能。

此外，來自西北大學合成與天然功能分子化學重點實驗室的范海明教授團隊利用類似上文的方式，使用實驗室觸手可得的槍頭完成了3D肝細胞培養(yǎng)，找到了槍頭培養(yǎng)的最適細胞液體積以及癌相關成纖維細胞與肝癌細胞的最適比例，并在此基礎上探究了線粒體靶向磁熱療的治療能力。研究中使用了TPP（線粒體受體靶向分子）修飾在磁珠表面實現(xiàn)對線粒體的靶向作用。

圖6 肝腫瘤橢球體重建檢測線粒體靶向磁療治療效果

實驗原理如圖7所示，研究者將規(guī)格為200μL的槍頭一分為二，留下寬大的一部分，將邊緣打磨光滑，將其中注入一定量的成纖維細胞與肝癌細胞混合液進行培養(yǎng)。在這部分中，研究者對混合培養(yǎng)液的體積進行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)當細胞液滴與槍頭切割面夾角a為30°時，細胞液體懸浮狀態(tài)最穩(wěn)定，能在槍頭尖端保持較長時間，此時的體積為50μL。

圖7 實驗原理圖。a圖顯示了使用槍頭培養(yǎng)的具體操作；b圖顯示了不同體積的細胞混合液在槍頭末端與槍頭截面形成的夾角a大?。╝代表80μL，a’代表50μL）；c圖顯示了夾角與細胞混合液體積的關系。

在本研究中使用的3T3成纖維細胞攜帶H2BGFP標記物，這使得它們很容易與非熒光HepG2細胞區(qū)分開來。在亮場和熒光成像中均可觀察到3T3成纖維細胞，而HepG2只能在亮場下觀察到。利用這一區(qū)別，研究則發(fā)現(xiàn)懸浮液滴中形成的球體具有層狀結(jié)構(gòu)，其中3T3成纖維細胞形成ECM外殼(綠色熒光)，核心為HepG2(黑色)。結(jié)果模型如下圖8B所示。

圖8 液滴中3T3成纖維細胞和HepG2細胞形成的肝球體的結(jié)構(gòu)特征。a圖顯示在液滴中培養(yǎng)3天后，顯示肝臟球體三維構(gòu)象的亮場圖像；b圖為模型示意圖；c圖展示了不同層位(z軸位置)肝球體的熒光圖像顯示，三維肝球體的外層主要由3T3成纖維細胞構(gòu)成，熒光標記物為H2BGFP；d,e圖顯示了在孔板培養(yǎng)7天后，球體逐漸降解。在圖2D中，右側(cè)面板的圖像是區(qū)域1和區(qū)域2的放大圖，顯示了3T3成纖維細胞和HepG2細胞的區(qū)域分布。圖E中的白色箭頭用H2B-GFP熒光標記物鑒定3T3成纖維細胞。

研究者同樣對肝癌細胞進行了染色。他們使用CMAC染色肝癌細胞。與之前GFP標記成纖維細胞的分布重疊發(fā)現(xiàn)，結(jié)論仍與前一致，即肝癌細胞在中央，成纖維細胞在周圍。

圖9 TPP-磁珠對肝癌細胞生存的影響。a圖顯示了鐵濃度與細胞存活率的關系，結(jié)果表明細胞存活率與鐵含量無關；b圖顯示了在沒有明顯的細胞毒性的情況下，添加和不添加TPP涂層的SPIONs的細胞攝取磁珠的數(shù)量都在孵育4小時后顯著增加，并在12小時后趨于飽和，?17pg /cell。長時間孵育至24小時，未見進一步增加，說明TPP涂層對細胞膜轉(zhuǎn)運SPIONs沒有影響；c圖顯示了對于磁熱療, TPP- spions可以誘導大約76%的HepG2細胞死亡，而在沒有TPP涂層的情況下，可以誘導約26%的HepG2細胞死亡。說明TPP可以很好的靶向線粒體，進而通過線粒體的損傷殺死癌細胞；d,e兩圖是用透射電鏡(TEM)觀察有無TPP包覆的SPIONs在細胞膜內(nèi)的內(nèi)化和分布。培養(yǎng)12 h后，無TPP包覆的SPIONs主要出現(xiàn)在核內(nèi)體或溶酶體中。然而，TPP-SPIONs進入線粒體，并保持球形。說明TPP可以很好的靶向線粒體。

通過消化肝腫瘤球體和測定鐵的含量來評估tpp - spions的攝取。結(jié)果與假設一致，即TPP-SPIONs的入侵受到球殼結(jié)構(gòu)的抑制，F(xiàn)e的攝取量在單層HepG2細胞中最高(?17pg /cell)，以球殼的形式最低(圖C)。球粒-100(低3T3比，1:10)與單層培養(yǎng)細胞(3T3比，1:10)相似，說明兩種情況下NPs均可與大多數(shù)細胞接觸。相比之下，位于球體中心(3T3比1:10)的細胞被“外殼”阻止與NPs接觸，這是鐵吸收量顯著下降的原因(圖C中的黃色條形圖)。長時間的培養(yǎng)皿培養(yǎng)至24小時不會影響細胞的整體生存能力。假設每個細胞接受相同數(shù)量的NPs，那么在球體培養(yǎng)中與NPs接觸的細胞數(shù)量約為單層培養(yǎng)細胞的40%。10分鐘后肝腫瘤球形內(nèi)細胞的整體活力與鐵的攝取量呈負相關(圖D)。在磁熱療過程中，TPP-SPIONs的效率是通過將細胞活力值正?；癁殍F的攝入量來評估的(圖E)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當HepG2細胞維持單層時，TPP-SPION誘導的細胞凋亡最顯著，而當處理肝腫瘤球形時，TPP-SPION誘導的細胞凋亡效果最差。

圖10 用吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)法測定3T3成纖維細胞和HepG2細胞的存活率，并分析其與肝橢球體組成的關系（圖片解釋見上文）

總的來說，范海明教授團隊運用前人3D細胞培養(yǎng)的理念，獨創(chuàng)了基于槍頭的3D球體細胞培養(yǎng)技術(shù)，并探究了TPP連接對于磁熱療的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由成纖維細胞與肝癌細胞共同組成的細胞球體會阻礙磁熱療的進行，作者推測是球殼結(jié)構(gòu)中形成的細胞外基質(zhì)（ECM）微環(huán)境阻礙了肝癌細胞對磁珠的攝入，具體原因有待后續(xù)探究。

點評：1.可以將肝細胞和成纖維細胞替代為其他細胞，以構(gòu)建其他組織模型并研究一般的細胞間相互作用。  2.作為高通量藥物篩選的體外肝模型，具備一定前景。3.文章2探究了SPIONs與TPP-SPIONs目前存在的問題。

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