細(xì)胞捕獲分離是免疫學(xué)、診斷檢測(cè)、病理研究等學(xué)科經(jīng)常用到的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法．近年來(lái)，微流控芯片平臺(tái)的細(xì)胞捕獲分離方式花樣繁多，層出不窮，它具有可快速檢測(cè)、所需樣本量少、節(jié)約試劑、成本低廉等優(yōu)勢(shì)。微流控細(xì)胞捕獲分離的方法，以免疫捕獲分離和無(wú)標(biāo)簽細(xì)胞分離兩類對(duì)其進(jìn)行介紹．免疫捕獲分離是較為傳統(tǒng)的細(xì)胞捕獲分離方式，它的特異性好、捕獲分離后的細(xì)胞純度較高．無(wú)標(biāo)簽細(xì)胞分離是近幾年熱門發(fā)展的技術(shù)手段，它采用物理學(xué)與生物學(xué)相結(jié)合的方式，能較好地保持細(xì)胞的完整性和生物活性。

細(xì)胞捕獲分離是指把在液體中的多種混合細(xì)胞通過(guò)物理學(xué)、化學(xué)、生物學(xué)等手段，從液體中分離出一種或幾種細(xì)胞的過(guò)程．細(xì)胞捕獲分離作為生物學(xué)、醫(yī)療診斷、毒理監(jiān)測(cè)等方面的重要實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，一直是實(shí)驗(yàn)室研究的一個(gè)熱點(diǎn)．細(xì)胞捕獲分離后可用于細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞免疫及細(xì)胞周期狀態(tài)觀測(cè)等后續(xù)實(shí)驗(yàn)，是一種必不可少的實(shí)驗(yàn)手段．

細(xì)胞計(jì)數(shù)與細(xì)胞捕獲分離的區(qū)分并不明確，細(xì)胞計(jì)數(shù)常會(huì)用到細(xì)胞捕獲分離作為前置手段，但很多細(xì)胞計(jì)數(shù)的手段和方法并不能適用于細(xì)胞捕獲分離．細(xì)胞計(jì)數(shù)只要求得到規(guī)定樣品中目的細(xì)胞數(shù)，可以通過(guò)破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)[1]或在混合樣品中直接針對(duì)特定細(xì)胞的電容、電阻進(jìn)行測(cè)定[2]，并不一定要對(duì)目的細(xì)胞進(jìn)行捕獲分離．而細(xì)胞分離則需要從樣本中有針對(duì)性地分離出所需細(xì)胞，往往對(duì)收集后的細(xì)胞還有較高的要求，需要保持細(xì)胞原有的形態(tài)，甚至一些實(shí)驗(yàn)還要求細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)正常，以便對(duì)其進(jìn)一步地觀察和研究．這就大大限制了細(xì)胞分離的方法，提高了難度．

細(xì)胞計(jì)數(shù)主要包括白細(xì)胞、紅細(xì)胞、循環(huán)腫瘤細(xì)胞等細(xì)胞計(jì)數(shù)．白細(xì)胞計(jì)數(shù)(包括CD3+/CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)等[3])常用于檢測(cè)炎癥反應(yīng)、人體免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，HIV)感染[4]、寄生蟲感染等與人體免疫相關(guān)的疾病[5]，其數(shù)值的升高和降低都會(huì)對(duì)體內(nèi)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生巨大影響，常作為人體健康狀況的重要參照指標(biāo)．紅細(xì)胞計(jì)數(shù)作為血常規(guī)的一個(gè)檢測(cè)指標(biāo)，常用于貧血、白血病等病癥的檢測(cè)．另外，近年來(lái)針對(duì)癌癥相關(guān)研究的不斷突破，計(jì)數(shù)檢測(cè)外周血中痕量循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulatingtumorcells，CTCs)也成為了癌癥診斷的一個(gè)生物標(biāo)志物，可以檢測(cè)癌細(xì)胞的遷移[6]．除細(xì)胞計(jì)數(shù)外，生物科學(xué)和醫(yī)療診斷的前期實(shí)驗(yàn)也常需要細(xì)胞分離技術(shù)，為后續(xù)如藥物刺激、細(xì)胞培養(yǎng)等實(shí)驗(yàn)研究做準(zhǔn)備．

目前細(xì)胞分離的手段多種多樣，如流式細(xì)胞分離、蔗糖密度梯度離心細(xì)胞分離、介電電泳分離[7]等。

微流控芯片技術(shù)是指把生物學(xué)、化學(xué)等實(shí)驗(yàn)的基本操作過(guò)程集成到一塊芯片上，其芯片內(nèi)部結(jié)構(gòu)中至少有一維為微米甚至納米尺度規(guī)格結(jié)構(gòu)，可以自動(dòng)完成實(shí)驗(yàn)及分析的全過(guò)程．由于微流控芯片具有集成性、高通量、檢測(cè)快速、操作便利、所需樣本量少、低耗能、低成本等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)其在藥物篩選、環(huán)境檢測(cè)、司法檢測(cè)、臨床診斷和生物醫(yī)藥研究等眾多科研與生活領(lǐng)域擁有越來(lái)越廣闊的應(yīng)用前景[2]．

微流控芯片主要是在微米尺度下操控的流通技術(shù)，但是與傳統(tǒng)的流通技術(shù)相比，微流控系統(tǒng)一個(gè)最重要特征就是微型化，而且同時(shí)要考慮便于攜帶和檢測(cè)，微流控芯片在精細(xì)結(jié)構(gòu)上要比流體技術(shù)更為復(fù)雜．微流控芯片的主要構(gòu)成部分根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c需求會(huì)有很大的不同，有關(guān)細(xì)胞捕獲分離的微流控芯片，大多包括進(jìn)樣管路、細(xì)胞捕獲或分離區(qū)域、廢液收集區(qū)和反應(yīng)檢測(cè)區(qū)幾部分(圖1)．進(jìn)樣管路和廢液收集區(qū)域?qū)儆诨緲?gòu)造，大部分微流控芯片的構(gòu)造也基本相近，并非是影響實(shí)驗(yàn)和微流控芯片的關(guān)鍵部分．而微流控芯片主要的功能區(qū)在于捕獲分離區(qū)和反應(yīng)檢測(cè)區(qū)，這兩部分也是不同微流控芯片的關(guān)鍵和特色區(qū)域．在捕獲分離區(qū)主要是根據(jù)細(xì)胞的大小形態(tài)等物理特性對(duì)目的細(xì)胞進(jìn)行分離攔截或特異性結(jié)合捕獲目的細(xì)胞．在反應(yīng)檢測(cè)區(qū)域，應(yīng)用光學(xué)傳感器是一類較為廣泛的檢測(cè)方法，此外還有表面等離子體共振(surfaceplasmonresonance，SPR)、波導(dǎo)管、熒光、單細(xì)胞表征分析和化學(xué)發(fā)光等檢測(cè)方法[8]．

圖1微流控芯片結(jié)構(gòu)示意圖

微流控芯片細(xì)胞捕獲分離主要方法

常見的微流控芯片細(xì)胞捕獲分離方法有磁珠捕獲分離[9-10]、微矩陣捕獲、微液滴分選[11-12]、聲波分離等方法，按最終捕獲分離細(xì)胞的狀態(tài)可分為免疫捕獲細(xì)胞分離和無(wú)標(biāo)簽細(xì)胞分離兩種(表1)．

免疫捕獲細(xì)胞分離的方法目前在生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用較廣，該類方法主要根據(jù)抗體可以特異性結(jié)合目的細(xì)胞表面抗原，借此分離目的細(xì)胞．其優(yōu)點(diǎn)在于可以特異性地捕獲目的細(xì)胞，所得到的細(xì)胞純度較高，也是目前普遍使用的細(xì)胞捕獲、計(jì)數(shù)方法．其缺點(diǎn)在于捕獲分離后的細(xì)胞表面多帶有捕獲抗體甚至其他標(biāo)記熒光、微珠等，不利于后續(xù)細(xì)胞的培養(yǎng)和狀態(tài)性質(zhì)的進(jìn)一步觀察研究，多用于細(xì)胞計(jì)數(shù)等檢測(cè)手段．

抗體特異性細(xì)胞捕獲是生物學(xué)上最常用到的捕獲方法，通過(guò)細(xì)胞表面的抗原與特異性抗體結(jié)合，固定抗體以捕獲細(xì)胞．對(duì)于抗體特異性捕獲細(xì)胞，抗體相對(duì)于捕獲細(xì)胞靶點(diǎn)的親和性是十分重要的．但是由于一個(gè)完整細(xì)胞要比抗原、抗體大很多，用一個(gè)或幾個(gè)抗原-抗體相結(jié)合很難抓住一個(gè)細(xì)胞，所以在抗體特異性細(xì)胞捕獲中，往往需要控制流速、采用多個(gè)結(jié)合點(diǎn)多次攔截捕獲細(xì)胞的方法[13-14]，加大細(xì)胞被捕獲的幾率(圖2a)．

磁珠細(xì)胞分離：磁珠標(biāo)記抗體特異性結(jié)合目的細(xì)胞，再通過(guò)磁力分離目的細(xì)胞，是實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常會(huì)用到的方法．磁珠捕獲細(xì)胞分離的方法應(yīng)用范圍廣泛，只要有可以與目的細(xì)胞特異性結(jié)合的抗體就可以有針對(duì)性地捕獲細(xì)胞．而且大多數(shù)情況下，磁珠捕獲細(xì)胞的特異性很高，但是磁珠的大小、抗體對(duì)細(xì)胞表面抗原的親和性強(qiáng)弱以及細(xì)胞所在緩沖液的黏稠度等因素對(duì)于目的細(xì)胞捕獲效率影響很大，尤其在細(xì)胞環(huán)境較復(fù)雜(如全血條件)時(shí)磁珠的捕獲效率較低．

表面張力不相容過(guò)濾篩選/非混相屏障細(xì)胞篩選：表面張力不相容過(guò)濾篩選(immisciblefiltrationassistedbysurfacetension，IFAST)是通過(guò)微尺寸物理現(xiàn)象建立的不相容液體流向壁壘(非混相屏障)[18]，不相容液相界面間具有較高的能量，形成一道屏障，可以阻止不想要的細(xì)胞或其他雜質(zhì)通過(guò)．Scott及其實(shí)驗(yàn)室利用IFAST方法從混合型的基質(zhì)細(xì)胞、熒光、全血中特異性分離乳腺癌細(xì)胞，效率大約為70%，純度＞80%，還可以通過(guò)多級(jí)非混相屏障提高分離純度．該方法符合微流控芯片操作特點(diǎn)，成本低廉、操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)快速，而且不需要洗去多余成分步驟，降低了洗滌步驟帶來(lái)的不確定性，但利用IFAST方法分離，在進(jìn)樣腔內(nèi)需要事先用磁珠捕獲目的細(xì)胞，再利用磁鐵把目的細(xì)胞從非混相腔吸出到收集腔(圖2c)，細(xì)胞結(jié)合磁珠可能對(duì)細(xì)胞的后續(xù)操作會(huì)有影響，如果可以尋找方法從非混相腔中直接獲得目的細(xì)胞，利用范圍會(huì)更廣．

圖2免疫捕獲細(xì)胞分離芯片結(jié)構(gòu)示意圖(a)抗體特異性細(xì)胞捕獲示意圖．(b)磁珠細(xì)胞分離芯片示意圖．(c)表面張力不相容過(guò)濾篩選芯片示意圖．

無(wú)標(biāo)簽細(xì)胞分離大多采用物理學(xué)中流體力學(xué)、慣性力等方法[19-20]，根據(jù)細(xì)胞自身物理形態(tài)或利用黏附分子等對(duì)細(xì)胞表面施加瞬間作用力，使不同細(xì)胞在微流控通道所受外力不同，從而達(dá)到細(xì)胞分離的目的．無(wú)標(biāo)簽細(xì)胞分離方法優(yōu)勢(shì)在于分離出的細(xì)胞表面無(wú)任何其他修飾，可以繼續(xù)培養(yǎng)及觀察細(xì)胞理化性質(zhì)．但無(wú)標(biāo)簽細(xì)胞分離由于是通過(guò)物理分離法，得到目的細(xì)胞常常純度不高，其中混雜有其他雜質(zhì)或非目的細(xì)胞．

小孔徑攔截細(xì)胞分離：由于不同細(xì)胞在大小、形態(tài)、剛性、透光度等方面都會(huì)有所差別，借由物理方法可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分離．目前所用物理方法分離細(xì)胞的手段也越來(lái)越多樣化，最基本的是根據(jù)細(xì)胞大小和外形差異，直接進(jìn)行分離．

非對(duì)稱流系統(tǒng)細(xì)胞分離：非對(duì)稱流分離系統(tǒng)(asymmetricalflowfield-flowfractionation，AFF)是通過(guò)不對(duì)稱分子模式的瞬間作用力，在物理方面廣泛運(yùn)用的側(cè)向位移，同時(shí)延長(zhǎng)了分子特異性標(biāo)簽的長(zhǎng)度，可以有效地從全血的持續(xù)液流中分離出白細(xì)胞．相對(duì)于垂直作用力的細(xì)胞連續(xù)分離方式(如電泳法、聲波法、引力作用、慣性作用、外磁場(chǎng)力等)，非對(duì)稱流分離系統(tǒng)通過(guò)黏附分子對(duì)細(xì)胞施加瞬間不對(duì)稱作用力，偏轉(zhuǎn)流動(dòng)過(guò)程中細(xì)胞的垂直方向作用力，不需要捕獲而達(dá)到細(xì)胞分離效果．這種微流控芯片的滾動(dòng)附著力是通過(guò)在微流控通道中修飾一層黏附分子P選擇素，施力作用于淋巴細(xì)胞表達(dá)的P選擇素糖蛋白配體1(P-selectinglycoproteinligand-1，PSGL-1)，使淋巴細(xì)胞滾動(dòng)方向發(fā)生偏移(圖3b)[24]．這種微流控芯片可以分離復(fù)雜環(huán)境中的目的細(xì)胞，細(xì)胞不需要標(biāo)記標(biāo)簽，避免不可逆的細(xì)胞捕獲，分離后細(xì)胞有較高的存活率及功能完整性。

聲波細(xì)胞分離是在芯片微通道兩側(cè)，通過(guò)聲波對(duì)細(xì)胞施加外力，由于細(xì)胞的大小、質(zhì)量、密度等物理性質(zhì)不同，所受聲波力不同，使細(xì)胞在微通道中偏轉(zhuǎn)角度改變，不同種細(xì)胞會(huì)流成幾股液流，在不同方向收集，以達(dá)到細(xì)胞分離目的．為了區(qū)分一些物理狀態(tài)相似細(xì)胞，也可以特異性標(biāo)記一些微珠在目的細(xì)胞表面，以此改變細(xì)胞的物理特性，而更好地分離出目的細(xì)胞．

微液滴細(xì)胞分離/熒光激活細(xì)胞分選：流式細(xì)胞術(shù)是細(xì)胞計(jì)數(shù)、分選及性質(zhì)分析中常用到的手段，微液滴細(xì)胞分離所用原理與其類似，但簡(jiǎn)化了流式細(xì)胞儀的復(fù)雜構(gòu)造．微液滴細(xì)胞分選整合了熒光激活細(xì)胞分選(fluorescence-activatedcellsorting，F(xiàn)ACS)[30]和微液滴芯片技術(shù)[31]，從單向微流控芯片技術(shù)改為T型結(jié)構(gòu)或流動(dòng)匯聚型結(jié)構(gòu)，樣品被鞘液包裹形成小液滴，目的細(xì)胞標(biāo)識(shí)熒光染料后通過(guò)檢測(cè)器[32]，激光激活染料熒光再利用光信號(hào)收集所要的目的細(xì)胞．微液滴細(xì)胞分離的精確度和純度都較其他微流控芯片方法更好，但芯片所需配套設(shè)備復(fù)雜，而且并不適合如全血等復(fù)雜環(huán)境下的細(xì)胞分離．

多路復(fù)用螺旋微流控芯片細(xì)胞分離：螺旋微流控芯片分離細(xì)胞是利用曲線微通道中迪恩旋渦流動(dòng)力原理，較大的CTCs在通道中的慣性上升力與內(nèi)壁作用力相抵消在螺旋通道內(nèi)壁流動(dòng)，而血液中其他較小的物質(zhì)則靠近外壁一側(cè)流動(dòng)(圖3e)，可以借此利用迪恩渦心力實(shí)現(xiàn)CTCs從全血中的分離。

圖3無(wú)標(biāo)簽細(xì)胞分離方法芯片結(jié)構(gòu)示意圖(a)小孔徑攔截酯膜電鏡圖．(b)非對(duì)稱流系統(tǒng)細(xì)胞分離示意圖．(c)斜角表面聲波技術(shù)細(xì)胞分離．(d)微液滴細(xì)胞分選．(e)多路復(fù)用螺旋微流控芯片細(xì)胞分離示意圖．

細(xì)胞捕獲分離一直是免疫學(xué)、診斷檢測(cè)、病理研究等學(xué)科經(jīng)常用到的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法．微流控芯片的主要優(yōu)勢(shì)在于：a．上樣體積小，節(jié)約原料、試劑與樣本；b．檢測(cè)結(jié)果單個(gè)周期短，可以實(shí)現(xiàn)快速測(cè)量，節(jié)約時(shí)間；c．適用于高通量檢測(cè)或宏觀尺度無(wú)法實(shí)現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)操作，具有低成本、高效快速的特點(diǎn)，在細(xì)胞分離過(guò)程中更易做到微觀操控、精準(zhǔn)分析．

在微流控芯片中，通過(guò)抗體捕獲、熒光標(biāo)記等標(biāo)簽標(biāo)記目的細(xì)胞后，多數(shù)情況下會(huì)對(duì)細(xì)胞本身產(chǎn)生一定的影響，大多只能用于捕獲分離后的細(xì)胞計(jì)數(shù)．無(wú)標(biāo)簽細(xì)胞分離多數(shù)是通過(guò)物理方法，利用微流控芯片的流體力學(xué)原理，從細(xì)胞大小、尺寸等方面實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分離．無(wú)標(biāo)簽細(xì)胞分離優(yōu)勢(shì)在于分離后的細(xì)胞既可用于細(xì)胞計(jì)數(shù)，也可用于細(xì)胞理化性質(zhì)觀察、細(xì)胞增殖培養(yǎng)等后續(xù)實(shí)驗(yàn)，也是目前細(xì)胞分離方法的主要發(fā)展方向，但相對(duì)于標(biāo)簽捕獲分離的方法，在純度和特異性上還需要提高．今后微流控芯片在細(xì)胞捕獲方面可能更傾向于非標(biāo)簽方式的捕獲分離，結(jié)合物理學(xué)與生物學(xué)的方法，根據(jù)所做實(shí)驗(yàn)的需要，在捕獲效率與純度方面更好協(xié)調(diào)，高效方便快捷地實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分離的目的．

用于細(xì)胞捕獲分離的微流控芯片需根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求選擇合適材料，如果要進(jìn)一步培養(yǎng)觀察分離出的細(xì)胞，還要確定細(xì)胞所在芯片環(huán)境是否無(wú)菌無(wú)毒，是否利于細(xì)胞存活生長(zhǎng)．微流控芯片材料一般有聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate，PMMA)、聚苯乙烯(polystyrene，PS)、玻璃、硅片等．
其中PDMS應(yīng)用最為廣泛，尤其在細(xì)胞捕獲分離實(shí)驗(yàn)中，PDMS具有較好的生物相容性和一定的透氣性，更有利于實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞的生長(zhǎng)存活及性質(zhì)分析，但芯片微結(jié)構(gòu)易變形，所以較難應(yīng)用于商業(yè)化大批量生產(chǎn)，而更適用于科研過(guò)程中芯片結(jié)構(gòu)及實(shí)驗(yàn)效果摸索．PMMA隨著材料及切割技術(shù)的發(fā)展越來(lái)越普及，在微流控芯片的實(shí)驗(yàn)室發(fā)展過(guò)程中逐漸得到了廣泛應(yīng)用．相信隨著微流控芯片技術(shù)和材料科學(xué)的不斷進(jìn)步，更多適用于實(shí)驗(yàn)要求的材料也會(huì)不斷為芯片的制作及商業(yè)化生產(chǎn)提供強(qiáng)有力的推動(dòng)，促進(jìn)微流控芯片技術(shù)更快更好地發(fā)展。

微流控芯片目前的發(fā)展策略主要有兩個(gè)方向：一類是利用微流控芯片高通量、上樣量小等優(yōu)勢(shì)，在科研過(guò)程中使用，解決一些在宏觀層面不易達(dá)成的實(shí)驗(yàn)問(wèn)題，這類芯片并不一定要求最終結(jié)果直接在芯片中顯示出來(lái)，而是作為一個(gè)高精密度的反應(yīng)容器，最后可利用實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的其他儀器配合實(shí)驗(yàn)，分析結(jié)果．另一類是以商品形式面向普通群眾為主要目的芯片，這類芯片往往需要有高度整合性，同時(shí)配備微型化的檢測(cè)及數(shù)據(jù)處理裝置，具有可手持診斷、價(jià)格適中、方便操作等優(yōu)點(diǎn)，使用者只需做簡(jiǎn)單加樣就可由儀器經(jīng)過(guò)暗箱處理后直接得到最終結(jié)果，體現(xiàn)了微流控芯片小型、簡(jiǎn)便、快速測(cè)定的優(yōu)勢(shì)．微流控芯片在細(xì)胞捕獲分離方面，目前主要集中于實(shí)驗(yàn)室層面，配合其他儀器使用，而后一類高度集成的微流控芯片還相對(duì)較少，且實(shí)現(xiàn)難度遠(yuǎn)高于前一種形式．但相信隨著微流控技術(shù)和構(gòu)造方法的進(jìn)一步發(fā)展，細(xì)胞捕獲分離技術(shù)的持續(xù)創(chuàng)新，基于微流控芯片的細(xì)胞捕獲、分離將在科學(xué)研究和臨床診斷中逐漸得到廣泛應(yīng)用，為提升人類健康水平做出貢獻(xiàn)．

免責(zé)聲明：文章來(lái)源《生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展》DOI: 10.16476/j.pibb.2016.0147 作者：董盛華 張晶 葛勝祥   以傳播知識(shí)、有益學(xué)習(xí)和研究為宗旨。 轉(zhuǎn)載僅供參考學(xué)習(xí)及傳遞有用信息，版權(quán)歸原作者所有，如侵犯權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)系刪除。