中國有句諺語，“工欲善其事，必先利其器”，為了闡明細胞的生命過程，需要特殊的工具。

細胞作為生命組成的最小單元，研究其相關(guān)的生物行為及其規(guī)律與本質(zhì)，對于揭示生命的奧秘，探索疾病的機理與治療手段，提高人類的生存壽命與質(zhì)量，都有著重要的意義。

對細胞的研究是一個復(fù)雜的工程，細胞在人體內(nèi)處于復(fù)雜的微環(huán)境之中，包括溫度、氧氣濃度、生物因子濃度、機械作用、細胞間相互作用、細胞基質(zhì)間相互作用等，同時，細胞體積微小、種類多樣，在細胞水平進行細胞識別、代謝物檢測、內(nèi)部組分分析、細胞結(jié)構(gòu)與功能表征、細胞間相互作用分析等工作也都有著很大的難度。

微流控（microfluidics）指的是使用微通道（尺寸為數(shù)十到數(shù)百微米）處理或操縱微小流體的系統(tǒng)所涉及的科學和技術(shù)，是一門涉及化學、流體物理、微電子、新材料、生物學和生物醫(yī)學工程的新興交叉學科。

因為具有微型化、集成化等特征，微流控裝置通常被稱為微流控芯片（microfluidic chip），又稱微全分析系統(tǒng)（micro total analysis system，μTAS）或者芯片實驗室（lab on a chip，LOC），于20世紀90 年代初開始引起人們的關(guān)注。微流控技術(shù)因具有一系列優(yōu)點，如樣品試劑消耗少、結(jié)構(gòu)功能多樣化、集成化程度高、與細胞尺度接近等，近年來被廣泛地應(yīng)用于細胞相關(guān)領(lǐng)域的研究，包括細胞培養(yǎng)、細胞捕獲、細胞分化、細胞遷移、細胞融合、藥物代謝、細胞通信、組織工程等，通過結(jié)合不同的分析檢測方法以及集成不同的功能操作單元，取得了巨大的研究進展，解決了很多傳統(tǒng)方法無法解決的問題。但是，如何在微流控芯片內(nèi)更加高效簡便地對細胞進行操控定位，如何更好地模擬細胞在生命體內(nèi)的生物微環(huán)境，從而進行體外生物系統(tǒng)的構(gòu)建，用于生命醫(yī)療疾病的研究，仍然需要在相關(guān)技術(shù)、材料、方法等方面做出更深入的研究。

《微流控芯片細胞分析》的英文版本由國際知名出版商Springer于2017年出版，問世后兩個月下載3000次，位列該年度top10。

該書從第1 章“微流控芯片的設(shè)計和制作”，至最后的第13 章“基于微流控技術(shù)的微生物學研究”，許多內(nèi)容來自作者實驗室的研究成果或者科研經(jīng)驗總結(jié)，深入淺出，簡單易懂。書中章節(jié)既有獨立性又有相關(guān)的參考性，以正在從事微流控芯片或者細胞分析研究的科研工作者以及開展博士論文或者碩士論文研究的研究生為讀者對象，盡最大可能地收集與每一章節(jié)有關(guān)的參考文獻。作者希望本書能夠幫助渴望了解更多有關(guān)微流控芯片和細胞分析相關(guān)知識的研究者和學生，并與所研制的細胞分析微流控芯片-質(zhì)譜聯(lián)用儀器進行配套，推動微流控技術(shù)的快速發(fā)展。

單細胞分析與微流控技術(shù)

大多數(shù)真核細胞都是單一的個體，但是在進化過程中，它們已經(jīng)可以互相關(guān)聯(lián)并密切相互作用形成組織、器官，甚至整個植物或者動物。然而，單細胞分析通常只關(guān)注組織或者器官中的單個細胞。即使在相同的培養(yǎng)條件下，同源細胞在單細胞層面上也會具有形態(tài)、基因表達水平以及生長特性上的差別。

此外，單細胞分析對于細胞內(nèi)生命過程的機理解釋具有重要的作用。當我們研究單個細胞，試圖理解它們?nèi)绾卧谏锵到y(tǒng)中發(fā)揮作用時，可以了解生命系統(tǒng)的發(fā)展，生命的成長和特殊化，以及單個細胞和整個生物體的進化。如果我們能在分子水平上理解生命現(xiàn)象，也許可以理解在細胞上的細微差別誘導生物現(xiàn)象如學習和記憶，或者了解細胞的微小改變導致疾病或者生命功能障礙，如癌癥。

為了開發(fā)新型的針對細胞層面的治療干預(yù)措施，對于生物異質(zhì)性及物質(zhì)傳輸通道的理解就變得尤其重要，這些研究會應(yīng)用到罕見但重要的細胞類型，如干細胞或祖細胞。由此，開發(fā)出了廣泛而多樣的單細胞分析研究方法，以分析它們的形態(tài)和生理特征，同時獲得分子、基因、轉(zhuǎn)錄和定量生物化學信息，甚至在模擬生物體內(nèi)條件的狀態(tài)下監(jiān)視細胞的動態(tài)變化。同時，在功能齊全的生物體內(nèi)，單個細胞可以被標記和追蹤，最終實現(xiàn)在細胞原本無干擾的自然環(huán)境中得到分析研究。

目前，單細胞分析面臨的挑戰(zhàn)是單個細胞的尺寸很小，因此分析技術(shù)必須能夠用于微量的樣本分析。然而，為了獲得足夠的有效的數(shù)據(jù)統(tǒng)計，實驗應(yīng)該實現(xiàn)高通量，同時實驗成本還應(yīng)該降低，以讓更多實驗室能夠在經(jīng)濟上負擔得起。在過去的幾年里，巨大的技術(shù)發(fā)展可以實現(xiàn)在所有領(lǐng)域的單細胞分析。單細胞分析是對細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄、翻譯、調(diào)控等內(nèi)部信號在單個細胞條件下分子水平的測量，其目標是從單個細胞層面上分析以全面地理解細胞種群。這個方法讓研究人員從分子的角度揭開單細胞與組織、器官甚至生命體的行為之間的聯(lián)系。單細胞分析技術(shù)在過去的十多年里獲得重要的發(fā)展，大量相關(guān)的科研工作得以發(fā)表。

單細胞分析研究領(lǐng)域正迅速地發(fā)展，許多研究從之前的大量細胞分析轉(zhuǎn)變?yōu)閱渭毎治?，這得益于對單細胞的異質(zhì)性和隨機性的研究。這些細胞種群的隨機變化可能是受種群內(nèi)在的影響。不同細胞個體在轉(zhuǎn)錄、翻譯等活動中存在差異，使得細胞內(nèi)的離子、mRNA 和蛋白等物質(zhì)表現(xiàn)出細胞間的異質(zhì)性。

由于細胞膜的靈活性和動態(tài)特性，反應(yīng)和分子碰撞會隨機發(fā)生。因此，在一個細胞種群中所有細胞在任何時刻都會存在一定的差異，只有大量的單細胞分析測試才能揭示它們的異質(zhì)性并提供統(tǒng)計數(shù)據(jù)，同時建立模型。在微流控技術(shù)發(fā)展的過程中，樣品前處理分析規(guī)模被微型化，使得樣品處理更加簡單方便。如今，微流控系統(tǒng)已經(jīng)可以應(yīng)用于廣泛的單細胞研究中。鑒于微流控技術(shù)的作用在單細胞分析中越來越明顯，可以預(yù)計不斷持續(xù)發(fā)展的微流控技術(shù)會更好地促進單細胞分析的發(fā)展。

基于微流控芯片的生物組織解離方法

傳統(tǒng)的組織培養(yǎng)需要在固定的時間點更換培養(yǎng)基，這樣可以持續(xù)為細胞提供營養(yǎng)，從而維持營養(yǎng)物質(zhì)和排泄物濃度在整個細胞的生命周期中保持穩(wěn)定。為了更好地創(chuàng)建一個模擬體內(nèi)組織流動的環(huán)境，Hattersley 等設(shè)計了一種微流控裝置，在芯片上灌注培養(yǎng)、分析、解離完整的鼠的肝組織，如圖1（a）所示。

實驗過程簡述如下：使用乙二醇四乙酸（EGTA）灌注固定的組織以清除Ca²⁺，然后灌注伯爵平衡鹽溶液（EBS）以清除EGTA，防止膠原酶被抑制。接下來，灌注膠原酶消化組織。最后，以高流速（500 μL/min）快速灌注冰冷的分散緩沖劑。被沖下來的分散的細胞可以直接在芯片的輸出口收集到離心管中。這種利用微流控芯片的組織解離方法可以減少組織或細胞暴露在未消毒的環(huán)境下的時間，從而減少污染的風險。然而由于解離時間較長，此方法并不適合在基因表達分析中使用。為了嚴格實現(xiàn)從生物組織中分離單細胞，Lin 等設(shè)計了一個微流控細胞解離芯片（μCDC）。這個芯片由50 μm 寬、167 μm 高、間距20 μm 的多個微柱組成，如圖1（b）和（c）所示。在這個工作中，將含有小鼠大腦腫瘤細胞DC115 和KT88 的神經(jīng)球組織用注射泵以3～15 mL/min的速率通過設(shè)計的微柱陣列后，最終解離成單個細胞。通過μCDC 芯片處理得到單細胞的產(chǎn)率在81%～85%之間，其中具有活性的單細胞產(chǎn)率在80%～85%之間。這個方法在解離生物組織時相比傳統(tǒng)的研磨法具有高產(chǎn)率的優(yōu)勢，細胞經(jīng)過芯片解離后，存活率會更高。然而由于機械分離的固有缺陷，分離的速率較慢。

圖1 （a）可以進行組織整體培養(yǎng)和解離的芯片[21]；（b）通過軟光刻技術(shù)及PDMS 制備的單通道μCDC 芯片；（c）生物組織通過微柱機械地分離為單個細胞的SEM 照片；（d）經(jīng)由芯片進行組織解離的芯片示意圖

基于微流控技術(shù)的細胞分選方法

微流控細胞分選技術(shù)的出現(xiàn)突破了熒光激活細胞分選法和磁激活細胞分選法的一些限制。相比于傳統(tǒng)的細胞分選方法，微流控裝置本質(zhì)上更有利于細胞分選。微流控設(shè)備微型化的特點，使得在實驗操作中試劑消耗量降低，同時提高了便攜性；制造微流控芯片可以使用標準的制造體系和軟光刻技術(shù)，大大降低了生產(chǎn)成本；在微流控芯片中簡化了實驗的操作步驟，同時還減少了細胞樣品污染的風險。

然而，微流控細胞分選需要進一步發(fā)展才能取代傳統(tǒng)的細胞分選技術(shù)。微流控系統(tǒng)相比商業(yè)流式細胞儀的主要缺點是分選通量和效率低。因此，提高其實驗效率是當前的一個研究重點。另外，通過軟光刻技術(shù)制造的微流控裝置在實驗中容易導致細胞黏附和堵塞，影響了它的使用壽命。

單細胞提取

微流控裝置在單細胞提取中具有許多優(yōu)勢。由于核糖核酸等生物分子在細胞中的含量可低至0.01～2.5 pg/單個細胞，這要求盡可能少地對提取出的單細胞進行稀釋。在微流控芯片中，每個單細胞通過芯片內(nèi)的固定結(jié)構(gòu)被分隔在不同的區(qū)域，每個區(qū)域通過微型化以減少裂解產(chǎn)物稀釋，這對于分析低含量的生物分子十分關(guān)鍵。微流控系統(tǒng)所消耗的試劑體積小，從而降低了實驗成本。提取出的單細胞可以通過顯微鏡可視化操作緊密排列。此外，大多數(shù)微流控系統(tǒng)完全是自動、封閉系統(tǒng)，減少了樣品污染的風險。

單細胞裂解

微流控系統(tǒng)為單細胞裂解提供了一個理想的平臺，由于芯片可以制造成特定的幾何形狀并且可以具有精確的尺寸大小，可以避免單細胞裂解中其他細胞的干擾。微流控芯片的長度與單個細胞相匹配從而使得稀釋程度最小化以增加檢測靈敏度。大部分芯片是光學透明的，允許可視化操作。微流控單細胞裂解方法有很多種，每種方法都有各自的優(yōu)點，這將在接下來的部分討論。根據(jù)不同的實驗影響因素，選擇合適的技術(shù)對于裂解的結(jié)果是至關(guān)重要的。

圖2 微流控芯片中利用機械力裂解單細胞的原理圖

單細胞分析檢測

單細胞分析的最后一個步驟是單細胞分析檢測。將細胞通過之前一系列步驟—組織解離、細胞分選、單細胞分離、單細胞裂解提取出所需要分析的物質(zhì)后，最后一步就是通過特定的方法對這些分子進行檢測和表征，進而得到所需要的細胞信息等。目前常用的單細胞分析手段主要包括熒光成像、電化學分析及質(zhì)譜分析三種方法。

1.單細胞熒光成像

在很長一段時間內(nèi)，熒光成像是使用最普遍的單細胞分析方法，它在單細胞分析研究中有著至關(guān)重要的作用。單細胞熒光成像在細胞內(nèi)化學成分的檢測方面有著獨特的優(yōu)勢。它能夠提供具有高對比度的化學物質(zhì)專一性圖像，并且能夠進行實時的活體成像。盡管熒光成像具有上述優(yōu)勢，但是它要求目標分子能夠產(chǎn)生熒光。對于本身沒有熒光的分子，需要通過化學標記或基因標記的手段使其帶上能夠發(fā)光的熒光官能團，這在一定程度上限制了熒光成像的應(yīng)用。發(fā)展新的熒光標記方法一直是熒光成像的研究熱點。另外，標記對代謝物分子本身的性質(zhì)有一定的影響，尤其是小分子代謝物。由于光譜重疊的問題，單細胞熒光成像也很難對多種代謝物進行同時成像。

2.單細胞電化學分析 

電化學方法能夠?qū)渭毎械拇x物進行實時定量檢測。以電化學方法在神經(jīng)科學上的研究為例，Adams在20 世紀70 年代對神經(jīng)遞質(zhì)方面的研究開創(chuàng)了這方面的先河。目前，電化學方法在單細胞分析上的應(yīng)用已經(jīng)不再局限于神經(jīng)遞質(zhì)的研究，而是拓展到了細胞內(nèi)的各種小分子或者大分子的研究。然而與熒光成像方法類似，電化學方法也難以實現(xiàn)多組分的同時檢測。

3.單細胞質(zhì)譜分析

質(zhì)譜是一種很適合于單細胞分析的檢測方法。它具有極高的靈敏度，能夠?qū)Χ喾N物質(zhì)同時進行檢測，而且具有對所感興趣的分子進行結(jié)構(gòu)鑒定的能力。目前，人們已經(jīng)發(fā)展出了多種離子化方法，這些方法能夠?qū)Σ煌愋偷臉悠愤M行解吸附/離子化，主要包括電噴霧/納米電噴霧離子化（ESI/nano-ESI）、激光剝蝕/激光解吸附離子化（LA/LDI）及二次離子化質(zhì)譜（SIMS）等。這些離子化方法能用于對不同種類的物質(zhì)進行離子化，如蛋白質(zhì)、多肽、酯類、小分子代謝物及元素等。由于單細胞質(zhì)譜分析無需標記，且能夠進行多組分的同時分析，因而在近年來的單細胞研究中逐漸受到關(guān)注。

單細胞分析是一個新興且迅速擴張的研究領(lǐng)域，在這個領(lǐng)域中不斷有新技術(shù)的出現(xiàn)，這使得人們很難預(yù)測領(lǐng)域內(nèi)未來的關(guān)注點和應(yīng)用。然而，不可否認的是，創(chuàng)新的微流控技術(shù)已經(jīng)在單細胞分析領(lǐng)域中做出了巨大的貢獻并將持續(xù)發(fā)揮重要的作用。在未來，很可能會出現(xiàn)更多用于組織分離的微流控裝置。然而，用于組織分離的微流控技術(shù)依然不如用于細胞分選的技術(shù)成熟，這是因為傳統(tǒng)的組織分離方法是最廉價和有效的。相比之下，細胞分選仍然由經(jīng)濟因素驅(qū)使，往往是需要隔離的稀有細胞群通過細胞分選的過程來富集。那么這個步驟就需要一個簡單、低成本、高通量的細胞分選系統(tǒng)，而這正是微流控裝置的優(yōu)勢所在。因此，我們預(yù)計微流控細胞分選領(lǐng)域的研究工作將會繼續(xù)增多。

現(xiàn)代的單細胞分析技術(shù)尤其令人興奮。在擴增、測序和微流控方面的技術(shù)進步使得我們可以通過前所未有的方式探測生命的基本單位—細胞。單細胞分析會在癌癥、免疫學、進化生物學、干細胞等研究中產(chǎn)生持久的影響。目前，研究人員通過將細胞從其生長的微環(huán)境轉(zhuǎn)移到分析緩沖區(qū)中研究單細胞。因此，細胞的原生環(huán)境的影響完全被剝離出來，而且細胞分析的過程也是不可逆轉(zhuǎn)的變化。人們普遍認為細胞的生長環(huán)境對于細胞內(nèi)的分子信號具有重大的影響，這也促進了微流控芯片在模擬生物內(nèi)環(huán)境的同時進行單細胞分析工作的發(fā)展。

微流控裝置相比傳統(tǒng)的單細胞分析裝置在實現(xiàn)單細胞多參數(shù)測量時有更大的潛力且有更快的測試速度。然而，微流控裝置的靈敏度和特異性仍然需要改進。在未來，微流控技術(shù)的發(fā)展將會帶來更多的應(yīng)用，使得單細胞分析領(lǐng)域繼續(xù)向前推進。

本文摘編自林金明著《微流控芯片細胞分析》之文前及第八章，內(nèi)容有刪減。