自從1985年美國科學(xué)家Kary Mullis發(fā)明PCR方法以來，該方法已經(jīng)成為生命科學(xué)研究領(lǐng)域中最常規(guī)的實驗方法之一。PCR方法就是在體外采用DNA聚合酶促反應(yīng)來特異性合成特定核酸片段達(dá)到富集的目的。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可用于下游多種應(yīng)用，如克隆表達(dá)、芯片雜交、突變檢測、測序等等。
  “三代PCR的發(fā)展”從PCR技術(shù)誕生至今，PCR技術(shù)已經(jīng)經(jīng)過了三代更迭。區(qū)分這三代的，主要是指PCR產(chǎn)物的檢測方式。

第一代PCR

第一代PCR采用電泳的方式對PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析，主要的分析內(nèi)容有：條帶大小、條帶數(shù)量、條帶濃度等。根據(jù)電泳條帶的這些信息能夠?qū)崿F(xiàn)研究者的某些實驗?zāi)康?，比如制?/span>DNA片段、檢測目的序列、對目的基因表達(dá)進(jìn)行定性分析等。第一代PCR的最大缺陷在于無法實現(xiàn)精確定量。一句話概括第一代PCR：看PCR產(chǎn)物的電泳條帶。

第二代PCR

第二代PCR即熒光定量PCR，它通過在反應(yīng)體系中加入能指示反應(yīng)進(jìn)程的熒光試劑來實時監(jiān)測熒光的積累，借助熒光曲線的Cq值來定量起始靶基因的濃度。但依賴于Cq值仍然是目前定量PCR最大的技術(shù)瓶頸，只有在規(guī)范的實驗流程、統(tǒng)一的設(shè)計思路下，得到的結(jié)果才具有可重復(fù)性和可比性。而且在低拷貝靶分子、模板濃度差異細(xì)微的條件下，其檢測的靈敏度、精確度都受到了限制。一句話概括第二代PCR：檢測反應(yīng)體系中熒光的實時變化。

第三代PCR

由于熒光定量PCR在定量方面的缺陷，第三代PCR即數(shù)字PCR應(yīng)運(yùn)而生，它采用直接計數(shù)目標(biāo)分子而不再依賴任何校準(zhǔn)物或外標(biāo)，即可確定低至單拷貝的待檢靶分子的絕對數(shù)目。實現(xiàn)這一過程的關(guān)鍵在于采用某種分散手段，使一個完整的PCR體系分散成為成千上萬個獨立的PCR體系，每個PCR體系中只包含一個或零個模板（實際每個微體系中的模板數(shù)符合泊松分布）。這樣，分別檢測這些體系是否發(fā)生了PCR反應(yīng)并且進(jìn)行計數(shù)，便可進(jìn)行精確定量。一個詞概括數(shù)字PCR的檢測方式：

數(shù)字PCR的計量方式——化一為萬

核酸樣品的分散是數(shù)字PCR中的第一步，也是最核心的步驟。從最早期的96或384孔，到如今已經(jīng)將反應(yīng)體系縮小至納升或皮升級別。

理想情況下，DNA模板應(yīng)該完全分散在不同的獨立反應(yīng)體系內(nèi)（如微孔或微滴內(nèi)）。這些微小的反應(yīng)體系互不干擾，儀器通過檢測每個微體系中的熒光變化來判斷里面是否有PCR反應(yīng)發(fā)生，若發(fā)生，即證明體系中有模板。

目前主流的樣本分散方式有兩種：以Thermo QuantStudio? 3D數(shù)字PCR系統(tǒng)為代表的微流控芯片法、以及以BIO-RAD QX200?數(shù)字PCR系統(tǒng)為代表的微滴法。

1微流控芯片——硅板蝕刻“小房間”

QuantStudio? 3D采用了高密度的納升流控芯片技術(shù)，芯片中有多達(dá)20,000個反應(yīng)孔，樣品加樣之后，會均勻分布到這些孔中，達(dá)到相互隔離的目的，PCR反應(yīng)之后，計數(shù)器會讀取每個微孔中得到熒光信號并計數(shù)。

2微滴法——油包水“小房間”

BIO-RAD QX200?統(tǒng)結(jié)合了油包水乳化微滴技術(shù)與微流體技術(shù)，借助微滴發(fā)生器，可將每個樣品生成20000 個均一的納升級微滴，目的片段和背景序列在微滴中隨機(jī)分布，每個微滴都是一個獨立的反應(yīng)器。在使用熱循環(huán)儀進(jìn)行 PCR 后，QX200 微滴分析儀將逐個分析每個樣品中的液滴。微滴被吸入后，管路將分解乳化的液滴，并使它們依次通過一個雙色光學(xué)檢測系統(tǒng)。系統(tǒng)將計算陽性和陰性微滴的數(shù)量，從而以數(shù)字格式對靶 DNA 進(jìn)行絕對定量分析。

以BIO-RAD QX200?數(shù)字PCR系統(tǒng)為例，詳細(xì)講解數(shù)字PCR的操作步驟和應(yīng)用舉例。

微滴式數(shù)字PCR——簡易操作流程

以BIORAD QX200微滴式數(shù)字PCR為例，為大家講解操作流程

從流程圖中可以看出，QX200 ddPCR的簡易操作流程包括以下幾個步驟：

1制備ddPCR反應(yīng)液

選用適宜的探針法預(yù)混液，振蕩混勻，離心除氣泡，注意所加樣本核酸含量不要超過規(guī)定檢測范圍(1~100000拷貝片段化核酸或者1~20000拷貝完整基因組DNA，如完整的人類基因組DNA不要超過66ng/20ul)，提前用限制性內(nèi)切酶處理樣本可提高檢測濃度。另外，用質(zhì)粒作為模板時建議酶切以消除復(fù)雜結(jié)構(gòu)，做CNV實驗時必須對DNA模板進(jìn)行高頻酶切；這樣做的目的是降低模板的粘稠度，更有利于模板的分散和微滴的形成。

2制備微滴

安裝

將8孔微滴生成板打開包裝，安裝到支架上，注意微滴生成板的方向與支架上標(biāo)記方向一致。

加樣

將20ul樣品反應(yīng)體系加入到微滴生成板中間一排的8個孔內(nèi)，不足8個樣品時用稀釋一倍的20ul 1×buffer control 補(bǔ)足，不能留空。在微滴生成板最底下一排 8 個孔中各加入 70ul 微滴生成油（DG Oil，探針法與染料法用不同的生成油），同樣不能留空。

微滴生成

蓋上膠墊，注意兩邊的小孔都要鉤牢；將其輕輕地平穩(wěn)放置于微滴生成儀中，開始生成微滴，注意儀器上指示燈狀態(tài)，一般約2分鐘即可完成。完成之后，微滴生成于板的最上面一排孔內(nèi)：

3進(jìn)行PCR擴(kuò)增

使用移液器，小心地從微滴生成板中吸取40μl，緩慢轉(zhuǎn)移至96孔PCR板中。由于數(shù)字PCR檢測的是每個液滴中最終是否含有熒光，從而判定微滴中是否含有模板，而不是實時觀測每個液滴或每管中熒光變化的循環(huán)數(shù)，因此，使用常規(guī)的熱循環(huán)儀即可進(jìn)行數(shù)字PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增的參數(shù)根據(jù)引物和模板決定，不再贅述。

4讀取并分析結(jié)果

結(jié)果讀取

PCR擴(kuò)增結(jié)束之后，每一孔中將有不同數(shù)量的微滴產(chǎn)生了熒光信號，接下來就需要讀取這些微滴，將每孔的微滴總數(shù)及含有熒光的微滴數(shù)統(tǒng)計出來。

將之前完成PCR的96孔板放入底座中組裝好，蓋好頂部支架，之后輕輕地平穩(wěn)放入微滴讀取儀中，如圖：

微滴讀取儀將依次吸取每孔中的微滴，依次讓微滴流過檢測器進(jìn)行熒光檢測，并對每一個微滴的相對熒光值進(jìn)行記錄。

數(shù)據(jù)分析

設(shè)定RFU的閾值之后，通過之前講述過的泊松分布，程序?qū)⒆詣佑嬎愠鲈擉w系中的模板濃度（copies/μl）。

當(dāng)檢測SNV基因型時，反應(yīng)體系中有兩條探針(如FAM-BHQ水解探針和VIC-BHQ水解探針)，程序?qū)⒏鶕?jù)您設(shè)定的閾值繪制二維聚類圖，從而計算出每個象限中的模板個數(shù)：

通過計算三個象限中微滴個數(shù)占總數(shù)量的比例，即可方便地計算出模板中野生純合子、突變純合子以及雜合子所占的比值。

當(dāng)然，除了檢測SNV，數(shù)字PCR還有很多廣泛的用途:

數(shù)字PCR——優(yōu)缺點與應(yīng)用

數(shù)字PCR的優(yōu)勢

得益于日益完善的“有限稀釋”技術(shù)，使得數(shù)字PCR在分析模板含量及組成方面有著無可比擬的靈敏度。相對于上一代qPCR，dPCR的優(yōu)勢體現(xiàn)在以下幾個方面：

高檢測靈敏度

傳統(tǒng)的常規(guī)PCR以及熒光定量qPCR，分別通過電泳條帶染色以及擴(kuò)增循環(huán)過程中熒光的增加來檢測模板DNA的含量，這兩種檢測方法決定了低拷貝數(shù)的模板難以檢測到。而數(shù)字PCR將一個傳統(tǒng)的PCR反應(yīng)分割成了數(shù)萬個體系，這些體系獨立擴(kuò)增，獨立檢測，保證了個位數(shù)的模板數(shù)量都可以被檢測到。

高定量精確度

使用qPCR進(jìn)行絕對定量，需要制備反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)待檢樣品和標(biāo)準(zhǔn)曲線的關(guān)系進(jìn)行換算，在反應(yīng)和換算過程中勢必會引入極大誤差。而dPCR拋棄了標(biāo)準(zhǔn)品，通過微體系的熒光計數(shù)，直接將反應(yīng)初始模板數(shù)量統(tǒng)計出來，即使某些微滴中的模板數(shù)量不止一個，也可以通過引入泊松分布提升其計算精確度。

高耐受性

當(dāng)反應(yīng)體系中有PCR抑制物存在時，常規(guī)的PCR體系經(jīng)常會受到影響。而dPCR第一步反應(yīng)體系的分配過程中，會導(dǎo)致模板和抑制物分配到不同的體系，從而顯著降低了抑制物的干擾。并且，與qPCR不同的是，dPCR檢測的是終點熒光，即使微體系稍微受到了影響，也不會影響最終結(jié)果的判讀。

數(shù)字PCR的不足

1.模板添加量要求較高

正是由于數(shù)字PCR將反應(yīng)拆分成了數(shù)萬個獨立體系，因此其對模板量有比較高的要求，如果模板量飽和，超過了微體系的數(shù)量，那么每個微滴都將有信號，無法進(jìn)行定量；反之，如果模板量太少，僅有幾個微滴產(chǎn)生熒光信號，勢必也降低了定量的準(zhǔn)確性。因此，進(jìn)行dPCR之前，需要摸索模板的添加量，將模板稀釋到合適的濃度，如同qPCR預(yù)實驗需進(jìn)行梯度稀釋找到合適的Cq值時的模板濃度一樣。

2.非特異性產(chǎn)物的判斷

不同于常規(guī)PCR和qPCR，可以分別通過電泳條帶和熔解曲線觀測特異性，數(shù)字PCR觀測的是每個體系中的終點熒光，無論P(yáng)CR產(chǎn)物是否是特異性產(chǎn)物，只要熒光信號足夠強(qiáng)，也是會判讀為陽性結(jié)果。因此dPCR的引物特異性要求極高，并且十分推薦采用特異性高的探針法而非染料法進(jìn)行實驗。

針對上述兩個問題，通常進(jìn)行dPCR之前，需要先進(jìn)行qPCR，根據(jù)Cq值來確定模板的稀釋倍數(shù)，并通過熔解曲線進(jìn)行擴(kuò)增特異性的判斷。

數(shù)字PCR的應(yīng)用

痕量核酸檢測

dPCR尤其適合對靈敏度要求非常高的核酸痕量分析研究，如環(huán)境水樣的微生物檢測等。在癌癥低頻突變檢測方面，在一份給定的樣本中，相比于野生型DNA，癌癥相關(guān)的突變序列比例較低，經(jīng)常無法檢測。而憑借其超高靈敏度，dPCR系統(tǒng)可以很容易地定量分析低至0.001%-0.0001%的突變頻率。突破了其他方法的局限性。使用數(shù)字PCR技術(shù)，研究人員現(xiàn)在能夠?qū)崿F(xiàn)對突變位點更細(xì)微的定量分析，更好地明確其在癌癥中的相關(guān)作用。

BRAF是人類最重要的原癌基因之一,大約8%的人類腫瘤發(fā)生BRAF突變。BRAF的絕大部分突變形式為BRAF V600E突變, 主要發(fā)生于黑色素瘤、結(jié)腸癌和甲狀腺癌中。該突變導(dǎo)致下游MEK-ERK信號通路持續(xù)激活,對腫瘤的生長增殖和侵襲轉(zhuǎn)移至關(guān)重要, 是抗黑色素瘤等V600E突變腫瘤的有效作用靶標(biāo)之一。dPCR系統(tǒng)的高靈敏度可以確保對野生型DNA背景下的BRAF V600E突變進(jìn)行精確的定量分析。

洞察病毒載量

精確的病毒載量分析對于闡釋疾病病程，后續(xù)治療及療效評估是至關(guān)重要的。病毒載量的波動，即使只下降了非常低的水平，意義卻是顯著的。在對病原體的研究中，能否實現(xiàn)準(zhǔn)確而可靠的病毒DNA或RNA定量分析，關(guān)系到實驗的成敗。

研究人員比較了qPCR和dPCR方法檢測臨床樣本中殘留的人類免疫缺陷病毒（HIV），其中包括功能性治愈的HIV感染嬰兒。研究人員發(fā)現(xiàn)，在檢測百萬個細(xì)胞內(nèi)的HIV DNA拷貝數(shù)時，相比于qPCR，dPCR的靈敏度提升了5倍；在檢測病毒長末端重復(fù)序列時，dPCR比qPCR靈敏提升了20倍。

區(qū)分基因組變異

在人類基因組中，拷貝數(shù)變異（CNV）是個體差異的一個重要來源。CNV與癌癥，神經(jīng)系統(tǒng)和自身免疫性疾病，藥物不良反應(yīng)有密切的關(guān)系?？煽康刈R別這類CNVs是開創(chuàng)性研究的一項重要手段。

拷貝數(shù)（CN）評估的主要技術(shù)瓶頸是如何在統(tǒng)計置信度下有效區(qū)分連續(xù)的CN。從根本上說，隨著CN增加，目標(biāo)遺傳物質(zhì)之間的差異百分比下降，這使得CNV的檢測更加困難。dPCR系統(tǒng)通過在成千上萬個微滴中進(jìn)行CNV特定片段的擴(kuò)增反應(yīng)，實現(xiàn)在卓越的統(tǒng)計置信度下，對更高連續(xù)拷貝數(shù)（例如5拷貝和6拷貝）的區(qū)分。

Bharuthram等按照標(biāo)準(zhǔn)方法分別使用qPCR和dPCR對CCL4L基因拷貝數(shù)進(jìn)行評估測定。研究表明，與qPCR(r=0.87，P<0.0001)相比，由dPCR測得CCL4L拷貝與CCL4L1和CCL4L2拷貝之和具有良好的相關(guān)性(r=0.99，P<0.0001)。而qPCR在高拷貝數(shù)時出現(xiàn)準(zhǔn)確性明顯下降。

NGS驗證及文庫定量

dPCR平臺可以方便地與下一代測序（NGS）文庫制備流程對接，精確定量測序文庫。 除了精確量化，QX200 系統(tǒng)所得到的結(jié)果包含測序文庫的定性信息，這是當(dāng)前其他方法所不具備的。這確保了文庫上樣量的一致性，提高NGS的使用效率與成功率。NGS運(yùn)行結(jié)束后，dPCR還能對NGS的結(jié)果進(jìn)行驗證，諸如單核苷酸多態(tài)性，突變及拷貝數(shù)變異在內(nèi)的基因組變異。

圖表顯示dPCR與MiSeq實驗結(jié)果的比較。對于上樣量100ng總RNA的低豐度轉(zhuǎn)錄子（TBP和GUSB基因），ddPCR檢測的拷貝數(shù)為幾千個copies/孔，這表明dPCR提高了檢測靈敏度。而MiSeq測序在每千堿基每百萬讀長（RPKM）中只檢測到個位數(shù)的記錄。相比于RNA測序，ddPCR在擴(kuò)增過程無偏差，且靈敏度提高了1000倍以上。

憑借簡便、可靠的特點，數(shù)字PCR已經(jīng)在癌癥分子標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，傳染病研究，基因組結(jié)構(gòu)變異分析，基因表達(dá)分析等領(lǐng)域展現(xiàn)出了強(qiáng)大的優(yōu)勢。但這僅僅是一個開始，隨著數(shù)字PCR的日益完善和改進(jìn)，該技術(shù)將廣泛應(yīng)用于醫(yī)療檢測、食品、環(huán)境農(nóng)林領(lǐng)域的各個方面。

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