近日，中國(guó)科學(xué)院國(guó)家納米科學(xué)中心研究員孫佳姝團(tuán)隊(duì)和中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心教授張少華等合作，開(kāi)發(fā)了新型微流控脈沖過(guò)濾技術(shù)與高靈敏熱泳檢測(cè)平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)了全血樣本中腫瘤細(xì)胞外囊泡（Extracellular vesicle，EV）的高效分離分析并用于乳腺癌早期診斷。相關(guān)研究成果以Cascaded microfluidic circuits for pulsatile filtration of extracellular vesicles from whole blood for early cancer diagnosis為題，發(fā)表在《科學(xué)進(jìn)展》（Science Advances）上。

細(xì)胞外囊泡（EV）是脂質(zhì)雙層封閉的生物顆粒，直徑為30至250nm，由大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞（尤其是腫瘤細(xì)胞）主動(dòng)分泌到周?chē)h(huán)境中，并在細(xì)胞間通訊中發(fā)揮重要作用（1-53）。腫瘤衍生的EV（tEV）攜帶反映細(xì)胞起源分子特征的蛋白質(zhì)和核酸的有效載荷，并且在血液等體液中大量發(fā)現(xiàn)。因此，電動(dòng)汽車(chē)被認(rèn)為是液體活檢生物標(biāo)志物的有前途的來(lái)源，用于早期癌癥診斷和腫瘤發(fā)展的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)（4-9）。然而，電動(dòng)汽車(chē)分析的一個(gè)主要障礙是缺乏標(biāo)準(zhǔn)化、自動(dòng)化和可重復(fù)的方法來(lái)分離和純化電動(dòng)汽車(chē)。為了從全血樣品中分離EV，包括超速離心（UC）在內(nèi)的順序離心現(xiàn)在是金標(biāo)準(zhǔn)，涉及多個(gè)離心步驟以去除血細(xì)胞，細(xì)胞碎片和其他干擾物質(zhì)（6，10，11）。整個(gè)工作流程既費(fèi)時(shí)又費(fèi)力，需要使用多種專(zhuān)用儀器。此外，較長(zhǎng)的UC周期可能導(dǎo)致具有蛋白質(zhì)聚集體共沉淀的EV產(chǎn)量低（12，13）。其他幾種分離方法，如基于聚乙二醇（PEG）的沉淀、體積排阻色譜、免疫親和捕獲和微流體分離，已被應(yīng)用于分離EV，在形態(tài)、純度和產(chǎn)量方面具有不同的結(jié)果（14-21）。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)高性能、快速、集成且具有成本效益的電動(dòng)汽車(chē)與生物體液隔離技術(shù)。

膜過(guò)濾是通過(guò)使用微/納米多孔膜作為尺寸排阻過(guò)濾器（尺寸排除過(guò)濾器）對(duì)EV進(jìn)行尺寸選擇性分離的替代策略（22，23）。據(jù)報(bào)道，集成了多個(gè)具有不同膜孔徑的過(guò)濾器模塊的外泌體全分離芯片可從血漿和尿液中分離出尺寸范圍為30至200nm的EV（24）。包含兩個(gè)納米過(guò)濾器的離心微流體裝置允許在30分鐘內(nèi)從尿液中自動(dòng)富集尺寸小于600nm的EV（25）。對(duì)于這些死角過(guò)濾設(shè)備，膜污染是一個(gè)主要問(wèn)題，會(huì)導(dǎo)致性能下降，電動(dòng)汽車(chē)回收率降低。此外，死端過(guò)濾中的高壓和剪切力可能會(huì)對(duì)EV（造成損壞26，27）。為了減少過(guò)濾器堵塞，設(shè)計(jì)了一種雙膜過(guò)濾方法，結(jié)合諧波振蕩，通過(guò)在膜表面周?chē)ㄆ谥貞褽V從尿液樣本中提取EV（14）。然而，高頻振蕩（3至7kHz）的應(yīng)用幾十分鐘可能會(huì)改變EV（的大小和完整性28，29）。此外，對(duì)復(fù)雜的外部控制系統(tǒng)的需求可能會(huì)限制膜過(guò)濾在臨床應(yīng)用中的廣泛使用。

在這里，我們?cè)O(shè)計(jì)了級(jí)聯(lián)微流體回路，用于直接從全血樣本中對(duì)EV進(jìn)行脈沖過(guò)濾（圖1A）。該平臺(tái)由一個(gè)安裝有外部聚碳酸酯（PC）膜過(guò)濾器（孔徑為600nm）的細(xì)胞去除電路和一個(gè)帶有陽(yáng)極氧化鋁（AAO）膜過(guò)濾器（孔徑為20nm）的EV隔離電路組成。在電路類(lèi)比的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)的微流體回路可以產(chǎn)生通過(guò)多孔膜的脈動(dòng)流，將顆粒從表面抬離，從而抑制過(guò)濾器結(jié)垢和顆粒聚集（圖1A）。微流體脈動(dòng)過(guò)濾可在 30 分鐘內(nèi)快速、高產(chǎn)、高純度地分離非轉(zhuǎn)移性乳腺癌 （NMBC） 血液樣本中的 EV。通過(guò)一步法PEG增強(qiáng)型熱泳適體傳感器（pTAS）在不到15分鐘的時(shí)間內(nèi)測(cè)量分離EV的蛋白質(zhì)譜，以診斷NMBC。

腫瘤EV是腫瘤細(xì)胞主動(dòng)分泌到外周血等體液環(huán)境中的納米尺度（30-250 nm）磷脂囊泡，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。發(fā)展簡(jiǎn)單、快速、高效且標(biāo)準(zhǔn)化的EV分離分析方法，已成為腫瘤液體活檢領(lǐng)域的關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題。

本工作利用流路-電路類(lèi)比設(shè)計(jì)策略，制備了集成微通道（電阻）、彈性薄膜（電容）、單向閥（二極管）等元件的微流控脈沖過(guò)濾系統(tǒng)。該系統(tǒng)僅需使用單向脈沖氣壓驅(qū)動(dòng)，便可產(chǎn)生可往復(fù)穿過(guò)多孔濾膜的微升級(jí)脈沖流，從而抑制濾膜堵塞和顆粒堆積，有效提升過(guò)濾效果。通過(guò)級(jí)聯(lián)600納米孔徑濾膜（用于血細(xì)胞去除）和20納米孔徑濾膜（用于游離蛋白、游離核酸、脂蛋白等干擾物去除），該方法可在30分鐘內(nèi)從全血樣本中高效完整地分離純化EV，回收率高達(dá)80%?？蒲腥藛T進(jìn)一步利用PEG增強(qiáng)熱泳的核酸適體傳感平臺(tái)，在15分鐘內(nèi)一步法高靈敏檢測(cè)EV攜帶的腫瘤相關(guān)蛋白，實(shí)現(xiàn)了早期乳腺癌患者精準(zhǔn)診斷，準(zhǔn)確率達(dá)91%。

研究工作得到中科院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專(zhuān)項(xiàng)、中科院穩(wěn)定支持基礎(chǔ)研究領(lǐng)域青年團(tuán)隊(duì)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金和國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃等的支持。

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