近期，一項(xiàng)基于微流控芯片技術(shù)的CTC檢測(cè)新方法出現(xiàn)，相關(guān)研究結(jié)果發(fā)表在國(guó)際化學(xué)領(lǐng)域頂級(jí)期刊《Angew Chem》上?！禔ngew Chem》是化學(xué)領(lǐng)域影響力最大的期刊之一，在業(yè)界享有極高的聲譽(yù)（2017，IF=11.994）。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC，Circulating Tumor Cell），即腫瘤在生長(zhǎng)過(guò)程中，向血液循環(huán)中釋放的各類(lèi)腫瘤細(xì)胞的總稱(chēng)，是導(dǎo)致腫瘤擴(kuò)散的關(guān)鍵因素。

CTC從腫瘤病灶脫離后進(jìn)入外周血隨血液流動(dòng)，沿著血流方向來(lái)尋找合適的“土壤”來(lái)生長(zhǎng)，最后要么被毛細(xì)血管截留或者粘附在血管壁上，要么就在外周血中循環(huán)最后被清除，只有極少數(shù)目的 CTC能附著在血管壁上，重新穿過(guò)血管，到達(dá)新的“土壤”，適應(yīng)環(huán)境后成長(zhǎng)為新的腫瘤。

CTC是一種生物標(biāo)志物（biomarker），這是目前臨床研發(fā)與應(yīng)用的重點(diǎn)，是被寄希望用于癌癥預(yù)后、分期診斷、療效監(jiān)控、復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)、用藥指導(dǎo)、早期檢測(cè)等的標(biāo)志物。與經(jīng)典組織活檢相比，具有腫瘤分子信息全、侵入性小、取樣方便、成本低等優(yōu)勢(shì)。

CTC檢測(cè)的最大困難在于其在外周血中含量稀少，通常1 mL外周血中含有109個(gè)紅細(xì)胞，106個(gè)白細(xì)胞，而可能只含有1-10個(gè)CTC，在如此龐大復(fù)雜的正常細(xì)胞背景干擾下，比如巨核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞，未成熟的造血細(xì)胞，上皮細(xì)胞等，很難實(shí)現(xiàn)高靈敏、高特異的CTC 捕獲檢測(cè)。

盡管目前市場(chǎng)有各種各樣用于分離及檢測(cè)CTC技術(shù)，但由于缺乏必要的敏感性，它們的臨床應(yīng)用并不被廣泛采用，大多數(shù)技術(shù)往往受到捕捉性的限制，在捕獲的高效率與高純度之間難以進(jìn)行權(quán)衡?，F(xiàn)在已經(jīng)使用的微型柱和人字形結(jié)構(gòu)成功的證明可以增加細(xì)胞和免疫表面相互作用，提高捕獲效率，可遺憾的是，這種增強(qiáng)的相互作用是非選擇性的，與非靶細(xì)胞相互作用的均等性機(jī)會(huì)將導(dǎo)致最后捕獲的CTC純度并不是很高。

Now，我們來(lái)了解這款新的CTC捕獲設(shè)備及方法：SDI-Chip，Size Dictated Immunocapture Chip，基于尺寸大小的免疫捕獲芯片技術(shù)。該項(xiàng)技術(shù)檢測(cè)CTC擁有更高的靈敏度、特異性及空間分辨率，SDI-Chip具有一定的選擇性，采用表面具有流體動(dòng)力優(yōu)化的免疫涂層微米柱，頻繁的互動(dòng)及擴(kuò)展來(lái)捕獲CTCs。不同抗原表達(dá)水平的CTC可以的有效地被微米柱所捕獲；在血樣中，CTC的捕獲效率大于92％，純度達(dá)到了82％，此次研究對(duì)象為非轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌（CRC）患者。

研究者開(kāi)發(fā)的基于流體力學(xué)分離與免疫識(shí)別的CTC捕獲富集芯片（SDI-Chip）技術(shù)，其內(nèi)構(gòu)建了成千上萬(wàn)個(gè)表面修飾有抗體的微柱陣列，微柱陣列排布方式根據(jù)確定性側(cè)向位移分離原理設(shè)計(jì)，CTC因尺寸較大將沿微柱偏移方向運(yùn)動(dòng)并不斷與微柱碰撞而實(shí)現(xiàn)特異性識(shí)別捕獲，而血細(xì)胞因尺寸較小將沿液流方向運(yùn)動(dòng)且很少與微柱碰撞而避免非特異性吸附。該設(shè)計(jì)有效地結(jié)合CTC在物理性質(zhì)及表面標(biāo)志物與背景細(xì)胞的差異，實(shí)現(xiàn)了CTC的高效、高純度協(xié)同捕獲。通過(guò)對(duì)大量臨床腫瘤病人外周血樣品的測(cè)試，該研究者驗(yàn)證了所發(fā)展的芯片技術(shù)在腫瘤分期診斷、療效監(jiān)控等方面的潛在應(yīng)用價(jià)值。

SDI-Chip由兩個(gè)鏡像一樣的包被上皮細(xì)胞粘附分子抗體（EpCAM）的微柱陣列組成，中間有一個(gè)樣品入口，并有上下兩個(gè)緩沖區(qū)入口（圖1）。

通過(guò)計(jì)算流體動(dòng)力學(xué)（CFD）用于對(duì)不同幾何形狀進(jìn)行排序，并進(jìn)一步優(yōu)化微柱的布置，與圓形和橢圓形微柱相比，三角形微柱提供更高的相互作用概率和較低的剪切應(yīng)力（圖2）。

為了可視化流動(dòng)模式和細(xì)胞與微柱的相互作用，研究者開(kāi)發(fā)了一個(gè)模擬將CFD與固體力學(xué)相結(jié)合的模型，將不同尺寸的球形顆通過(guò)路上的微柱，然后粒泵送到出口，見(jiàn)圖3及視頻1：

大于臨界直徑（Dc，13μm）的顆粒在與之相互作用的過(guò)程中被迫偏轉(zhuǎn)離并交叉流線于微柱。由于每一列微柱被安排的與上一行偏離，大顆粒不斷與每一個(gè)微柱相互作用，導(dǎo)致流動(dòng)形成了偏斜角。相比之下，小于Dc的粒子仍然以原始流線運(yùn)行，并減少與微柱的相互作用。模擬結(jié)果使用聚苯乙烯（PS）珠證實(shí)了實(shí)驗(yàn)觀察到相同的流動(dòng)模式，見(jiàn)圖4及視頻2：

總體而言，發(fā)現(xiàn)了20μm微粒的相互作用概率大于95％，10um微粒相比有顯著提高，相互作用僅有5.5％。結(jié)果證明，SDI-Chip可以選擇性地增強(qiáng)大顆粒與微柱相互作用。由于CTC的大小通常大于血細(xì)胞，這樣的大小選擇性相互作用可以高效率和高純度的免疫捕獲CTC。

圖5E.以順時(shí)針旋轉(zhuǎn)一個(gè)三角形的微柱，到15o在它的軸線周?chē)峁┝艘粋€(gè)更光滑的水動(dòng)力梯度不影響細(xì)胞流動(dòng)模式的力量。

圖5F. 由于流體的影響，水動(dòng)力的梯度下降與旋轉(zhuǎn)的三角形微柱的斜坡相互作用產(chǎn)生增加了粘附力的梯度。因此，每個(gè)相互作用，ctc遷移到一個(gè)水動(dòng)力區(qū)域減小梯度，致使流速減小，導(dǎo)致與免疫組織微量柱接觸的持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)。

SDI – Chip進(jìn)行了傳統(tǒng)軟光刻技術(shù)優(yōu)化，后表面改性，抗體固定化和濃度優(yōu)化，捕獲芯片的性能驗(yàn)證使用了EpCAM-陽(yáng)性SW480懸浮液細(xì)胞作為靶細(xì)胞（1000細(xì)胞/ml），293T細(xì)胞（EpCAM-陰性/罕見(jiàn)表達(dá)EpCAM）的懸浮液細(xì)胞和白細(xì)胞（WBCs）（106細(xì)胞/ml）作為對(duì)照細(xì)胞，通過(guò)50μm的最佳通道深度和流量為1ml/h的設(shè)備進(jìn)行檢測(cè)。

圖7. (A)表面化學(xué)改性和EpCAM抗體固定過(guò)程的示意圖。(B)顯微照相熒光標(biāo)記靶(SW480)細(xì)胞在緩沖或血液中分散，對(duì)照細(xì)胞(293T和WBCs)與免疫球蛋白SDI-Chip的結(jié)合。(C)和(D)顯微攝影顯示熒光標(biāo)記SW480細(xì)胞的近視野。(規(guī)模:100μm)。

通過(guò)在Buffer中摻入SW480細(xì)胞，SDI– Chip的捕獲效率為99.2±3.5％，純度為92.4±4.6％（圖8C），同時(shí)研究者也展示了SDI芯片的臨床潛力，使用血液樣品進(jìn)行細(xì)胞的捕獲實(shí)驗(yàn)，通過(guò)將1000個(gè)SW480細(xì)胞加入1mL健康血液中來(lái)制備供體的血液。平均捕獲效率和純度分別為92.2±6.4％和82.3±3.8％（圖8D）。如此高的捕獲效率和純度是歸因于基于DLD原理的免疫接種相互作用。此外，具有由旋轉(zhuǎn)提供的流體動(dòng)力的梯度，在微柱表面上延長(zhǎng)接觸時(shí)間，三角形微柱也被認(rèn)為有助于提高捕獲效率。此外，靶細(xì)胞等血液細(xì)胞流向芯片的空間不同的區(qū)域，這可以減少目標(biāo)細(xì)胞的競(jìng)爭(zhēng)性脫落并確保在高細(xì)胞背景下存在高捕獲效率。

剪切力的流體動(dòng)力學(xué)梯度圍繞旋轉(zhuǎn)的三角形微柱產(chǎn)生（圖9A）允許根據(jù)其抗原來(lái)描述捕獲CTC微柱周?chē)谋磉_(dá)水平。細(xì)胞表達(dá)較高表面抗原量的CTC形成較強(qiáng)可以抵抗由于剪切而產(chǎn)生的移動(dòng)力的結(jié)合，并且被捕獲在三角形微柱的頂端附近。另一方面，表達(dá)細(xì)胞表面抗原相對(duì)較少量的CTC不會(huì)形成足夠強(qiáng)的抵抗力脫落力，因此，他們將沿著斜坡向下移動(dòng)（較低的剪切應(yīng)力面積），直到它們形成足夠牢固的粘結(jié)以抵抗該地區(qū)的流體動(dòng)力。

捕獲的SW480細(xì)胞使用微透鏡觀察使用熒光標(biāo)記的EpCAM抗體染色的CTC，來(lái)評(píng)價(jià)EpCAM表達(dá)水平熒光強(qiáng)度（圖9B）。與低細(xì)胞的熒光強(qiáng)度相比，熒光強(qiáng)度較高的細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)被捕獲在剪切應(yīng)力的區(qū)域相對(duì)較高。這樣的空間解決捕獲使我們能夠評(píng)估在芯片中捕獲的CTC的抗原表達(dá)水平，通過(guò)觀察CTC圍繞微柱的捕獲位置及抗原進(jìn)行其他下游分析。

在SDI- Chip的免疫染色后，采集CTC和白細(xì)胞的樣品顯微圖（圖10）：

用EpCAM、CK、CD45抗體、DAPI對(duì)SDI- Chip進(jìn)行免疫染色后，采集CTC集群的樣品顯微攝影（圖11）：

作為一款新的CTC捕獲技術(shù)，怎么能不跟行業(yè)的標(biāo)桿CellSearch?進(jìn)行比對(duì)呢！（雖然CellSearch的缺點(diǎn)很多人都知道，但是它畢竟是行業(yè)內(nèi)第一款獲批的CTC產(chǎn)品啊?。?/span>

通過(guò)比較SDI-Chip與CellSearch?可以發(fā)現(xiàn)：SDI-Chip的CTC檢出率明顯高于CellSearch?，達(dá)到近乎90%的檢出率，關(guān)鍵人家使用的是1ml血哦（圖12）。

(A)在健康血液樣本中使用SW480細(xì)胞的回收率比較。

(B)CellSearch成像結(jié)果。

(C)利用SDI-Chip和CellSearch對(duì)CRC病人的臨床發(fā)現(xiàn)及回收細(xì)胞數(shù)量比較。

國(guó)內(nèi)液體活檢產(chǎn)業(yè)正在如火如荼的蓬勃發(fā)展，各種技術(shù)都在日新月異的變化，無(wú)疑會(huì)帶來(lái)更多市場(chǎng)格局的變化，從研究到臨床轉(zhuǎn)化研究再到臨床應(yīng)用，是一個(gè)漫長(zhǎng)而嚴(yán)謹(jǐn)?shù)牡缆?，希?/span>CTC技術(shù)能夠早日成熟，造福于更多的腫瘤患者！

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