細(xì)胞微環(huán)境酸化是惡性腫瘤的特征之一，與正常細(xì)胞的氧化磷酸化代謝途徑不同，腫瘤細(xì)胞的代謝方式主要為糖酵解，其代謝終產(chǎn)物以乳酸為主。乳酸的大量產(chǎn)生及排泄障礙使腫瘤細(xì)胞處于較低的ｐＨ微環(huán)境中。腫瘤微環(huán)境的酸化不僅影響癌細(xì)胞的代謝和遷移，而且影響化療藥物對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。因此，建立腫瘤微環(huán)境酸化實(shí)時(shí)監(jiān)測模型對腫瘤的代謝和治療具有重要意義。

腫瘤細(xì)胞的生長環(huán)境空間狹小、液體量少，其ｐＨ值難以用傳統(tǒng)的電化學(xué)ｐＨ計(jì)測出。目前，微量ｐＨ檢測方法主要包括ｐＨ敏感微電極法、ｐＨ敏感熒光染料法和核磁共振法等方法，這些方法需要特殊的設(shè)備，且操作復(fù)雜、成本昂貴，很難在一般實(shí)驗(yàn)室中開展?，F(xiàn)有的腫瘤微環(huán)境酸化檢測方法缺少仿真３Ｄ結(jié)構(gòu)，不能模擬細(xì)胞的擴(kuò)散屏障所導(dǎo)致的酸性代謝產(chǎn)物蓄積，且難以實(shí)時(shí)檢測，結(jié)果偏差較大。

微流控芯片技術(shù)因具有結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)靈活和規(guī)模集成的特點(diǎn)逐漸成為細(xì)胞研究的重要手段。本研究以微流控芯片為平臺、海藻酸鈉水凝膠為載體，乳腺癌ＭＣＦ?７細(xì)胞為研究對象，成功構(gòu)建了細(xì)胞生長的微環(huán)境。同時(shí)利用芯片通道的連續(xù)灌流模擬體內(nèi)的微血管系統(tǒng)，以及時(shí)提供營養(yǎng)、排除廢物。同時(shí)將造價(jià)低廉的非電化學(xué)ｐＨ指示器引入微流控芯片中，通過固定光源拍照，將顏色信號轉(zhuǎn)化為ｐＨ值，實(shí)現(xiàn)對微環(huán)境ｐＨ值的實(shí)時(shí)監(jiān)測。

１實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器、試劑與材料

激光共聚焦顯微鏡、ＡＵ２７００全自動(dòng)生化分析儀；聚二甲基硅氧烷（ＰＤＭＳ）前體及引發(fā)劑；硝酸纖維素薄膜；ＦＥ２０酸度計(jì)；ＴＳ?２Ａ微量注射泵。

吖啶橙（ａｃｒｉｄｉｎｅｏｒａｎｇｅ，ＡＯ）、溴化乙錠（ｅｔｈｉｄｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ，ＥＢ）；乳腺癌ＭＣＦ?７細(xì)胞、乳房ＢＨＬ?１００細(xì)胞；海藻酸鈉、明膠、胰蛋白酶、氯化鈣（ＣａＣｌ２）、磷酸二氫鈉（ＮａＨ２ＰＯ４）、磷酸氫二鈉（Ｎａ２ＨＰ百里酚藍(lán)、酚酞、溴百里酚藍(lán)、甲基紅、氫氧化鈉（ＮａＯＨ）、磷酸鹽緩沖液（ＰＢＳ）、臺盼藍(lán)染液；ＤＭＥＭ培養(yǎng)基、ＭｃＣｏｙ?Ａ培養(yǎng)基；所有溶液用二次滅菌的蒸餾水配制。

1.２芯片制作

芯片采用標(biāo)準(zhǔn)軟蝕刻加工技術(shù)，即在玻璃板上旋涂ＳＵ８光膠，然后遮蔽含有微通道圖形的掩膜，曝光及顯影處理后得到ＳＵ８模具。在含有ＳＵ８結(jié)構(gòu)的基板上澆注ＰＤＭＳ，獲得微結(jié)構(gòu)。芯片包含３層結(jié)構(gòu)（見圖１ａ），頂層灌流通道的長、寬、高分別為４ｃｍ、１４０μｍ、１８０μｍ，中央厚度為２２０μｍ，底部有一個(gè)６ｍｍ×６ｍｍ的方形凹槽，通道末端為直徑２.５ｍｍ的圓形通孔，作為ｐＨ檢測口；中間層有一個(gè)５ｍｍ×５ｍｍ的方形通孔，作為細(xì)胞培養(yǎng)池；底層是玻璃平板。中間層與底層結(jié)合將直徑５ｍｍ的紙片分裝于中間層底面的凹槽內(nèi)。中間層和底層等離子處理后封接，中間層ＮＣ膜分別用０.１％（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）明膠和２％（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）海藻酸鈉溶液處理并烘干，與頂層封接后得到芯片。

1.3芯片實(shí)驗(yàn)操作

先將微量注射器、毛細(xì)管和制備好的芯片于９０℃烘烤１ｈ后，置于紫外燈下照射過夜。乳腺癌ＭＣＦ?７細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，待細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)成長期后制成密度為１×１０７ｃｅｌｌ／ｍＬ的細(xì)胞懸液。將２００μＬ細(xì)胞懸液緩慢注入芯片中，排除多余液體后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)２ｈ，向芯片通道緩慢引入４０ｍｍｏｌ／ＬＣａＣｌ２，引發(fā)海藻酸鈉聚合，以３０μＬ／ｈ的速度進(jìn)行連續(xù)灌注培養(yǎng)（見圖２）。

圖２芯片灌流示意圖

1.4細(xì)胞培養(yǎng)分析

細(xì)胞連續(xù)灌流培養(yǎng)５ｄ后，將熒光染液ＡＯ?ＥＢ（１∶１，ｖ／ｖ）注入芯片通道染色１０ｍｉｎ后，將芯片置于激光共聚焦顯微鏡下檢測，觀察芯片培養(yǎng)池內(nèi)部細(xì)胞的結(jié)構(gòu)形態(tài)。同時(shí)為考察芯片灌流與普通靜態(tài)培養(yǎng)的差異，將相同數(shù)量的細(xì)胞放入培養(yǎng)皿中靜態(tài)培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)液，于５ｄ后將其熒光染色，同芯片培養(yǎng)情況進(jìn)行對比。

將細(xì)胞分別培養(yǎng)１～７ｄ后，拆開芯片，從細(xì)胞培養(yǎng)池中取出水凝膠微球于干凈的離心管中，加入圖３細(xì)胞熒光染色圖（放大倍數(shù)１０×１０）生理鹽水使水凝膠微球溶解，再加入適量胰酶消化細(xì)胞團(tuán)塊，以２０００ｒ／ｍｉｎ離心１ｍｉｎ后，沉淀重懸于２００μＬＰＢＳ溶液，混勻，滴加臺盼藍(lán)染液染色，加入細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)總細(xì)胞數(shù)及存活細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞存活率為存活細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)的百分比。細(xì)胞增殖率（ｐ）是培養(yǎng)不同天數(shù)的細(xì)胞數(shù)（ｎｄ）相對于前一天的細(xì)胞數(shù)（ｎｄ－１）增加的比率，即ｐ＝（ｎｄ－ｎｄ－１）／ｎｄ－１×１００％。

1.5ｐＨ檢測器構(gòu)建

稱?。?/span>.５ｍｇ百里酚藍(lán)、１０ｍｇ酚酞、６ｍｇ溴百里酚藍(lán)、１.２ｍｇ甲基紅，加入１０ｍＬ９５％（ｖ／ｖ）乙醇水溶液，用０.０１ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ滴定，直至溶液變?yōu)榫G色，將此溶液作為指示劑。將指示劑定量滴入芯片通道出口的ｐＨ檢測器后，隨ｐＨ值的不同而呈現(xiàn)不同顏色。將芯片插入帶有固定光源的拍照裝置（見圖１ｂ）進(jìn)行拍照后，通過ＰｈｏｔｏｓｈｏｐＣＳ２軟件分析照片的紅綠藍(lán)色彩（ＲＧＢ）模式值，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，將光學(xué)數(shù)值轉(zhuǎn)變?yōu)椋穑戎?，從而?shí)現(xiàn)ｐＨ值的測定。

1.6微環(huán)境酸化檢測

以３０μＬ／ｈ的灌流速度持續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，分別收集１、２、３、４、５、６、７ｄ時(shí)的灌流液，比較其乳酸水平和ｐＨ值的對應(yīng)關(guān)系，同時(shí)在相同的培養(yǎng)條件下比較乳腺癌ＭＣＦ?７細(xì)胞和正常乳房ＢＨＬ?１００細(xì)胞在７ｄ內(nèi)的微環(huán)境ｐＨ值的變化情況。同時(shí)通過降低灌流速度，考察其對微環(huán)境酸化情況的影響。

２結(jié)果與討論

2.1３Ｄ腫瘤細(xì)胞微環(huán)境的模擬

2.1.1腫瘤間質(zhì)的模擬

明膠處理過的ＮＣ膜具有親水作用，在疏水性ＰＤＭＳ材料上形成親水區(qū)，一定濃度的細(xì)胞懸液通過通道灌流進(jìn)入ＮＣ膜區(qū)域后，在重力和表面張力的作用下迅速鋪滿整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)池。細(xì)胞懸液進(jìn)入培養(yǎng)池后，與ＮＣ膜上的海藻酸鈉逐漸混合，當(dāng)接觸到Ｃａ２＋時(shí)海藻酸鈉固化為水凝膠微球，為３Ｄ細(xì)胞培養(yǎng)提供支撐。水凝膠微球中的明膠和海藻酸鈉含有選擇素和整合素成分，具有促進(jìn)細(xì)胞黏附的作用。水凝膠微球?yàn)榧?xì)胞生長提供了適宜的間質(zhì)硬度及支撐、連接和營養(yǎng)作用，同時(shí)可避免流體剪切力對細(xì)胞的傷害，很好地模擬了體內(nèi)腫瘤間質(zhì)。

2.1.2腫瘤實(shí)質(zhì)的模擬

體內(nèi)細(xì)胞均為３Ｄ立體式生長而非平面生長。將芯片進(jìn)行灌流培養(yǎng)和靜態(tài)培養(yǎng)，均培養(yǎng)１ｄ和５ｄ，分別向各自細(xì)胞培養(yǎng)池中引入ＡＯ?ＥＢ（１∶１，ｖ／ｖ）染液染色，用激光共聚焦顯微鏡觀察，比較兩種培養(yǎng)條件下細(xì)胞培養(yǎng)池中細(xì)胞與間質(zhì)、細(xì)胞與細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)的變化和不同（見圖３）。結(jié)果表明，在灌流條件下，培養(yǎng)１ｄ時(shí)，乳腺癌細(xì)胞由于生長時(shí)間尚短并未聚集形成微球（圖３ａ）；而培養(yǎng)５ｄ時(shí)，細(xì)胞聚集生長，形成大小不等的微球（圖３ｂ），提示細(xì)胞呈３Ｄ立體式生長，與體內(nèi)細(xì)胞生長方式接近。而在靜態(tài)條件下，培養(yǎng)１ｄ時(shí)（圖３ｃ）與灌流培養(yǎng)相比，二者無明顯差別；但隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，灌流培養(yǎng)與靜態(tài)培養(yǎng)下的細(xì)胞雖然在成球速度上差別不大，但細(xì)胞存活率明顯提高（圖３ｄ），說明灌流培養(yǎng)比靜態(tài)培養(yǎng)更接近體內(nèi)細(xì)胞的生長狀況。

圖３細(xì)胞熒光染色圖（放大倍數(shù)１０×１０）

2.2細(xì)胞生長分析

在灌流速度為３０μＬ／ｈ時(shí)，分別連續(xù)培養(yǎng)１、３、５、７ｄ，計(jì)算細(xì)胞的存活率；在此條件下，連續(xù)灌流培養(yǎng)７ｄ，計(jì)算細(xì)胞的增殖率（見圖４）。結(jié)果表明，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，細(xì)胞存活率逐漸下降，但一直保持在９０％以上；細(xì)胞在第１ｄ時(shí)的增殖率最高，達(dá)到４５％，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，細(xì)胞增殖率逐漸下降，但仍保持在２０％以上。細(xì)胞的密度隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加而持續(xù)增加，說明細(xì)胞在水凝膠微球中不斷增殖，與２Ｄ細(xì)胞培養(yǎng)相比，由于營養(yǎng)成分和生長空間的限制，倍增時(shí)間顯著緩慢。

圖４灌流培養(yǎng)下細(xì)胞的（ａ）存活率和（ｂ）增殖率（ｎ＝３）

2.3微環(huán)境的酸化檢測

將濃度為０.２ｍｏｌ／ＬＮａＨ２ＰＯ４和Ｎａ２ＨＰＯ４按適當(dāng)比例混合，配制ｐＨ值為６.５～７.４的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。ｐＨ檢測器中加入定量的指示劑和標(biāo)準(zhǔn)溶液后，因ｐＨ值的不同而顯示出不同顏色，通過軟件分析不同ｐＨ值對應(yīng)的ＲＧＢ模式中的紅（Ｒ）、綠（Ｇ）、藍(lán)（Ｂ）值。研究表明，Ｒ值與ｐＨ值的關(guān)系最為密切，將Ｒ值取對數(shù)后與ｐＨ值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖５），可獲得不同顏色對應(yīng)的ｐＨ值。

圖５ｌｇＲ與ｐＨ值的關(guān)系（ｎ＝３）

在灌流速度為３０μＬ／ｈ時(shí)，連續(xù)培養(yǎng)乳腺癌ＭＣＦ?７細(xì)胞７ｄ，每天測定癌細(xì)胞的ｐＨ值和乳酸水平（見圖６）。結(jié)果表明，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，乳腺癌ＭＣＦ?７細(xì)胞微環(huán)境的ｐＨ值逐漸下降；在６ｄ時(shí)，逐漸形成一個(gè)相對穩(wěn)定的酸化微環(huán)境，腫瘤細(xì)胞在此酸化微環(huán)境下仍能正常增殖。在相同的條件下培養(yǎng)乳房ＢＨＬ?１００細(xì)胞，其微環(huán)境的ｐＨ值始終保持在中性范圍內(nèi)（圖６ｂ），與腫瘤細(xì)胞形成鮮明對比。同時(shí)對比ＭＣＦ?７細(xì)胞的ｐＨ值和乳酸水平，發(fā)現(xiàn)二者之間存在顯著關(guān)聯(lián)（圖６ｃ），說明乳酸是引起ｐＨ值變化的重要原因

圖６乳腺癌和乳房細(xì)胞的微環(huán)境酸化情況（ｎ＝３）

本實(shí)驗(yàn)考察了灌流速度對乳腺癌細(xì)胞微環(huán)境酸化情況的影響（見圖６ｄ）。在不影響ＭＣＦ?７細(xì)胞存活率的基礎(chǔ)上，將灌流速度降至６μＬ／ｈ，監(jiān)測其在７ｄ內(nèi)微環(huán)境的ｐＨ值，由于營養(yǎng)物的供給和代謝物的排泄存在一定障礙，ＭＣＦ?７細(xì)胞在３ｄ時(shí)就形成了相對穩(wěn)定的酸化微環(huán)境。

３結(jié)論

利用微流控芯片的特性可以實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞微環(huán)境的有效模擬和對微環(huán)境酸化進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測。本實(shí)驗(yàn)借助海藻酸鈉與Ｃａ２＋固化為水凝膠的特性，為細(xì)胞生長提供支架，構(gòu)建３Ｄ細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境，同時(shí)將價(jià)格低廉的非電化學(xué)ｐＨ檢測器集成到芯片上，實(shí)現(xiàn)對微環(huán)境ｐＨ值的實(shí)時(shí)監(jiān)測。本實(shí)驗(yàn)建立的腫瘤細(xì)胞微環(huán)境酸化檢測平臺為動(dòng)態(tài)監(jiān)測腫瘤細(xì)胞周圍酸堿度的變化、分析癌細(xì)胞耐藥和轉(zhuǎn)移提供了科學(xué)依據(jù)。 

文獻(xiàn)來源色譜ＤＯＩ：１０．３７２４／ＳＰ．Ｊ．１１２３．２０１６．０７０１１作者：嚴(yán)偉，徐德順等（轉(zhuǎn)載僅供參考學(xué)習(xí)及傳遞有用信息，版權(quán)歸原作者所有，如侵犯權(quán)益，請聯(lián)系刪除）