近年來,人們在紙質(zhì)芯片的制作和應(yīng)用研究中發(fā)現(xiàn)，紙質(zhì)芯片由于機械強度低,在操作過程中容易造成對基質(zhì)材料本身和芯片圖形的損壞,使得其應(yīng)用受到了限制。因此,尋找新的基質(zhì)材料并制作出具有較高應(yīng)用價值的薄膜芯片尤為必要.本文對一系列薄膜基質(zhì)材料進行了篩選,并對制作工藝進行了改進,制作了一種基于尼龍微孔薄膜的芯片。進一步將葡萄糖氧化酶和辣根過氧化物酶固定在該薄膜芯片上,利用酶促化學(xué)反應(yīng)對葡萄糖樣品進行了研究,并通過顏色變化對不同濃度的葡萄糖進行顯色分析。研究結(jié)果表明,這種新型尼龍微孔薄膜芯片具有實際應(yīng)用價值。

1實驗部分

1試劑與儀器

乙醇和氫氧化鈉(分析純);碘化鉀(分析純)、葡萄糖(分析純)、葡萄糖氧化酶(Glucoseoxidase,GOD)和辣根過氧化物酶(Horseradishperoxidase,HRP)。

聚醚砜樹脂濾膜(PES,孔徑0-22滋m)、聚偏氟乙烯濾膜(PVDF,孔徑0-22滋m)、聚四氟乙烯濾膜(PTFE,孔徑0-45滋m)、醋酸纖維素濾膜(CA,孔徑0-22滋m)、混合纖維樹脂濾膜(水膜,孔徑0-22滋m)和尼龍濾膜(Nylon,聚己二酸己二胺,孔徑0-45滋m)的厚度均為100滋m。SC-B型勻膠臺；GP18正型紫外光刻膠；URE-2000/35型深紫外光刻機;CT-946型電熱板；PDC-MG等離子體清洗器。

2實驗過程

2.1尼龍薄膜微孔微流控芯片的制作

芯片的制作過程如圖1所示.首先將厚度為100滋m左右的尼龍微孔薄膜浸潤到紫外光刻膠中2~3min,待微孔薄膜被光膠充分浸潤后,取出薄膜并滴瀝多余的光膠,常溫下放置5~10min,使光膠初步固化,再將此薄膜放置在電熱板上于80益烘烤15min,以形成堅硬的薄膜光膠層。采用高分辨激光打印在黑白膠片上制作用于設(shè)定的通道形狀的掩膜。將掩膜覆蓋在光膠層上進行紫外光刻,10min后光刻結(jié)束,將曝光過的紫外光膠用7-0g/L的氫氧化鈉溶液進行清洗,形成目標(biāo)通道圖形。然后將薄膜芯片用去離子水清洗,使其處于中性的pH值環(huán)境.再將此薄膜芯片置于電熱板上于80益烘干10min,制得干燥的薄膜芯片,然后用等離子體處理1min,以增強其親水性,即制得所需的尼龍微孔薄膜微流控芯片.

2.2葡萄糖的檢測

將葡萄糖氧化酶和辣根過氧化物酶的混合溶液(濃度均為30U/mL)滴加在薄膜微芯片的圓形反應(yīng)檢測區(qū)域(圖1中的3個外圍圓形區(qū)域),待其干燥后在相同的位置滴加相同體積的0-6mol/L碘化鉀溶液,在空氣中自然揮干后待用.

Fig.1Fabricationprocessofmembrane-basedmicrofluidicchip

將不同濃度的葡萄糖樣品溶液滴加在芯片的進樣位置(圖1中的中心圓形區(qū)域),該溶液通過沿通道的自由擴散可到達芯片的反應(yīng)檢測區(qū)域.。10min后反應(yīng)結(jié)束,通過反應(yīng)產(chǎn)物顏色的響應(yīng)變化來實現(xiàn)對不同濃度的葡萄糖的檢測分析。將反應(yīng)顯色完全的的芯片拍照后,采用Photoshop圖形軟件將所獲電子圖片轉(zhuǎn)化為8位(bit)的灰度圖片,在灰度圖片上選取反應(yīng)顯色區(qū)域,利用Photoshop軟件讀取這一區(qū)域所有像素點的灰度強度平均值,然后減去空白區(qū)域像素點的灰度強度,即得真實顏色的強度改變值。基于此,根據(jù)葡萄糖濃度對顏色強度值進行線性擬合即可實現(xiàn)對葡萄糖樣品的定量檢測[23].

2結(jié)果與討論

1薄膜芯片的制作

1.1薄膜材料的選擇

選取了一系列薄膜基質(zhì)材料用于薄膜微流控芯片的制作。由于正性紫外光膠具有一定的溶解能力,所以要求所選的薄膜材料能夠在光刻膠中穩(wěn)定存在。通過對混合纖維素酯膜、聚四氟乙烯膜和尼龍膜等多種薄膜研究比較后發(fā)現(xiàn),紫外光刻正膠能很好地浸潤混合纖維素酯膜,但長時間的浸潤會導(dǎo)致該薄膜變形、溶解,因此不適于芯片的制作。聚四氟乙烯膜因具有較好的機械強度而被認為是一種理想的芯片制作材料,但研究發(fā)現(xiàn)由于紫外光刻正膠具有一定的親水性,而聚四氟乙烯膜卻具有極強的疏水性,因此導(dǎo)致光刻正膠無法在四氟乙烯膜表面均勻分布并形成厚度均一的薄膜層,故聚四氟乙烯膜也無法用于薄膜芯片的制作。相比之下,尼龍薄膜的親疏水性質(zhì)與光刻正膠具有良好的兼容性,可以在其表面形成厚度均一的光膠薄膜,且內(nèi)部微孔也能得到充分的浸潤.此外,尼龍薄膜由于自身的材料屬性而能在光刻膠中穩(wěn)定存在,因此它是一種理想的制作薄膜芯片的基質(zhì)材料。

1.2芯片通道寬度的選擇

由于薄膜芯片具有微孔的性質(zhì),液體在通道中的流動可以不依靠附加的驅(qū)動裝置而通過毛細擴散來完成,所以液體在不同寬度的通道中會具有不同的浸潤速度,而且不同寬度的光膠隔離帶對液體的阻擋作用也不同。我們在直徑為50mm的尼龍微孔濾膜上加工了一系列具有不同寬度的微通道和光膠隔離帶(見圖2),考察了液體在不同寬度的微通道中的浸潤能力和光膠隔離帶對液體的阻擋作用.結(jié)果表明,微通道越窄,液體在通道中的浸潤速度越慢且浸潤距離越短,反之則浸潤速度越快且浸潤距離越長。當(dāng)微通道采用等離子體處理后,雖然其親水性得到增強,但仍然存在著相同的浸潤趨勢。

Fig.2Fabricatedmicrochannels(unitinmicrometers)(A)andbarriers(B)withvariedwidths(unitinmicrometers)

實驗中還發(fā)現(xiàn),當(dāng)微通道寬度大于400滋m時,液體就可以保持穩(wěn)定的速度浸潤整個通道;另外,形成的光膠隔離帶越窄,對液體的阻擋作用越弱.因此,為引導(dǎo)液體能夠按照既定的流路流動,光膠隔離帶必須具有足夠的寬度以實現(xiàn)對液體的阻擋,并防止液體擴散的發(fā)生。進一步的實驗結(jié)果表明,當(dāng)光膠隔離帶寬度達到240滋m時即可起到有效的阻擋作用;當(dāng)其小于240滋m時,隨著光膠隔離帶寬度的減小,液體滲過光膠隔離帶的速度變得更快。對光膠隔離帶和微通道的進一步優(yōu)化后發(fā)現(xiàn),所制作的尼龍薄膜芯片不僅通道規(guī)則、邊緣光滑,還具有較高的分辨率,并可對流體實現(xiàn)更準(zhǔn)確控制.

2.1.3其它影響因素的考察

在尼龍薄膜芯片的制作過程中發(fā)現(xiàn),所形成的光膠層的厚度對流體在芯片通道中的浸潤性具有顯著影響.這是由于紫外光刻產(chǎn)生的芯片通道的深度有一定的限制,因此當(dāng)光膠層較厚時,紫外光將無法完全穿透整個光膠層,所刻蝕的通道會因光膠的殘存而對液體的浸潤具有明顯的阻礙作用;而當(dāng)光膠層較薄時,目標(biāo)通道周圍由于缺乏對光膠的有效阻攔,導(dǎo)致在芯片中流動的液體滲透到通道以外的其它區(qū)域.可見,控制薄膜光膠層的厚度對流體在通道中的浸潤具有關(guān)鍵的作用。在芯片的實際制作過程中,將尼龍薄膜用光膠充分浸潤后置于勻膠臺上,通過調(diào)節(jié)勻膠的轉(zhuǎn)速來控制光膠的厚度,轉(zhuǎn)速越高、轉(zhuǎn)動時間越長,所得到的薄膜光膠層厚度越薄,反之則越厚。實驗結(jié)果表明,選擇轉(zhuǎn)速為300r/min,轉(zhuǎn)動時間為20s時,可在尼龍薄膜上獲得厚度為150滋m的最適光膠層。

由于該尼龍薄膜芯片將主要用于對取自生物和環(huán)境等領(lǐng)域樣品的檢測,而所涉及的樣品大多具有親水性,因此增強芯片通道的親水性尤為必要.在得到干燥、規(guī)則的尼龍薄膜芯片后,進一步對尼龍薄膜芯片通道采用等離子體處理2min,使液體在芯片通道中的浸潤性和浸潤速度明顯增強.

2.2葡萄糖的檢測

如圖3(A)所示,在外圍3個圓形區(qū)域中分別滴加1滋L葡萄糖氧化酶(GOD)和辣根過氧化物酶(HRP)的混合溶液(體積比5頤1,酶濃度均為30U/mL),待其在常溫下自然揮干后,繼續(xù)滴加1滋L0郾6mol/L的碘化鉀溶液,再在常溫下自然揮干.然后,在中心圓形區(qū)域中滴加待測葡萄糖樣品溶液1滋L,待反應(yīng)10min結(jié)束后,即可對其進行顯色響應(yīng)分析

檢測機理:含有葡萄糖的樣品溶液通過尼龍薄膜微孔的毛細擴散作用到達檢測區(qū)域;葡萄糖在GOD的酶促催化作用下生成葡萄糖酸和過氧化氫[反應(yīng)式(1)],所產(chǎn)生的過氧化氫在HRP的催化下會進一步與碘化鉀反應(yīng)生成水和碘單質(zhì)[反應(yīng)式(2)];通過對碘單質(zhì)顏色深淺的觀察即可判斷樣品中葡萄糖的含量。

實驗中發(fā)現(xiàn),此尼龍薄膜芯片上外圍圓形檢測區(qū)域面積的大小對樣品中葡萄糖的檢測靈敏度影響明顯。外圍圓形區(qū)域面積越大,所生成的碘單質(zhì)越分散,顏色越淺;反之,所生成的碘單質(zhì)則越集中,顏色越深,檢測靈敏度越高.因此,在綜合考慮浸潤速度和反應(yīng)區(qū)域的面積對葡萄糖檢測靈敏度的影響后,最終選擇尼龍薄膜芯片的通道寬度為1mm,外圍圓形反應(yīng)區(qū)域的直徑為3郾5mm.

Fig.3Schematicpatternsofmicrochannelsusedforglucoseassays(A),blankexperiment(B)andthechangedcolorofiodinewith10郾0mmol/L(C),25郾0mmol/L(D),50郾0mmol/L(E)ofglucose

對一系列不同濃度的葡糖糖樣品溶液進行了顯色響應(yīng)研究,發(fā)現(xiàn)碘單質(zhì)顏色的深淺對樣品中的葡萄糖濃度的高低具有明顯響應(yīng).樣品中葡萄糖的濃度越高,所生成的碘單質(zhì)顏色越深[圖3(E)];而濃度越低則顏色越淺[圖3(C)];與空白實驗[圖3(B)]相比,最淺顏色所對應(yīng)的葡糖糖的濃度為10-0mmol/L.

研究發(fā)現(xiàn),葡萄糖樣品溶液的滴加速度也會對顯色響應(yīng)反應(yīng)產(chǎn)生較大的影響.滴加速度過慢會導(dǎo)致待測溶液難于到達檢測區(qū)域,因此會延長顯色響應(yīng)反應(yīng)的時間;而滴加速度過快則易導(dǎo)致試樣溢出通道區(qū)域。實驗選擇的葡萄糖樣品溶液的滴加速度為2滋L/min,既可達到預(yù)期的實驗設(shè)計效果,又可使顯色響應(yīng)反應(yīng)在10min內(nèi)完成。

為驗證方法的重復(fù)性及穩(wěn)定性,在不同的尼龍薄膜芯片上進行了平行實驗.在圖3(A)所示的芯片上,對特定濃度的葡萄糖進行分析檢測,1次操作就可獲得3個平行檢測結(jié)果;而進一步進行3次平行檢測操作,就能獲得9個平行檢測的結(jié)果.然后對這9個結(jié)果所產(chǎn)生的顏色強度進行灰度值分析,用獲得的相應(yīng)數(shù)據(jù)來考察此檢測方法的重復(fù)性.對濃度為25-0mmol/L的葡萄糖溶液進行了3次平行分析,9個測定結(jié)果的平均偏差為2-0%,標(biāo)準(zhǔn)偏差為3郾0%.以上結(jié)果表明,該方法穩(wěn)定可靠,可對樣品中的葡萄糖濃度水平進行準(zhǔn)確有效的顏色響應(yīng).

顯色區(qū)域的圖片經(jīng)過處理后可得到其灰度強度值,對灰度強度值與葡萄糖濃度之間的關(guān)系進行了研究.結(jié)果表明,灰度強度值隨著葡萄糖濃度的增大而上升,但濃度越大,強度變化幅度越小并趨于平緩[圖4(A)].值得一提的是,雖然檢測區(qū)域內(nèi)的顏色深淺與碘單質(zhì)的分散程度有關(guān),但采用Photoshop軟件讀取像素灰度平均值時,是對整個圓形反應(yīng)區(qū)域進行讀取,然后求其平均值,因此不太均一分布的碘單質(zhì)顏色不會對最終的計算結(jié)果造成影響.在0~30郾0mmol/L范圍內(nèi)對碘單質(zhì)的顏色灰度強度鄄葡萄糖濃度之間的關(guān)系進行了線性擬合,其線性方程為

式中,y為碘單質(zhì)的顏色灰度強度值,x為葡萄糖溶液的濃度(mmol/L).該方法對葡萄糖的最低檢測濃度為5mmol/L.將此法用于健康人尿液中葡萄糖的含量檢測,結(jié)果如圖4(B)所示.當(dāng)在健康人的尿液中添加濃度為10郾0mmol/L的葡萄糖溶液時,以碘單質(zhì)的顏色灰度強度所測得的實際葡萄糖的濃度為(10郾0依0郾4)mmol/L.結(jié)果表明,該方法可滿足定量分析實際樣品中葡萄糖的要求.

Fig.4Plotofmeanintensityasafunctionofglucoseconcentration(A)andthechangedcolorofiodinefromurineassay(B)

3結(jié)論

以尼龍微孔薄膜為基質(zhì)材料,采用光刻法制作了一種新型薄膜微流控芯片。通過對制作工藝進行優(yōu)化和改進,使薄膜芯片的制作步驟及周期大為簡化和縮短。在該芯片上固定葡萄糖氧化酶和辣根過氧化物酶后,利用二步酶促化學(xué)反應(yīng)實現(xiàn)了對不同濃度葡萄糖的顯色響應(yīng)。結(jié)果表明,所制作的尼龍薄膜微流控芯片具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性,可用于實際生物樣品中葡萄糖的檢測。 

文獻來源高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報doi:10.7503/cjcu20120349作者：楊俊，齊莉，馬會民，陳義（轉(zhuǎn)載僅供參考學(xué)習(xí)及傳遞有用信息，版權(quán)歸原作者所有，如侵犯權(quán)益，請聯(lián)系刪除）