癌癥作為常見病正嚴(yán)重威脅著我國乃至全球居民的健康。循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）是一類由癌變部位釋放并進(jìn)入血液中的癌細(xì)胞，其在癌癥的早期診斷、個(gè)體化及腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制研究等方面的作用正逐漸被發(fā)現(xiàn)和認(rèn)可，但由于血液中的CTCs含量極少，對(duì)其分選極具挑戰(zhàn)。微流控芯片作為一種微型化、高通量、集成化平臺(tái)，在CTCs研究中彰顯了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，相關(guān)報(bào)道也越來越多。隨著研究的深入，微流控芯片技術(shù)不再局限于基于模型樣品的方法學(xué)開發(fā)，而是更注重于能否用于臨床實(shí)際樣品中CTCs的檢測(cè)，但目前未見該角度的綜述報(bào)道。為此，文章綜述了近年來用于臨床實(shí)際樣品CTCs分析的微流控芯片分選技術(shù)，并探討了微流控芯片用于CTCs分選的發(fā)展趨勢(shì)。

隨著人口老齡化進(jìn)程的加快, 我國每年約有160萬人新患癌癥, 同時(shí)有約130萬人因癌癥死亡, 癌癥作為常見的疾病已成為我國乃至全球居民的主要死因。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells, CTCs)的檢測(cè)因在腫瘤早期診斷、治療效果評(píng)估、腫瘤復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)等方面彰顯了巨大的潛力, 已引起廣泛的關(guān)注, 并成為當(dāng)前癌癥研究的熱點(diǎn)。1869年, Ashworth首先在血液中發(fā)現(xiàn)CTCs, 它是指從原發(fā)病灶或者轉(zhuǎn)移灶脫落后進(jìn)入外周循環(huán)血液系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞。CTCs最早出現(xiàn)于腫瘤早期階段, 可以作為癌癥早期篩查的項(xiàng)目。同時(shí), CTCs被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的必要前提, 它會(huì)對(duì)宿主組織器官產(chǎn)生威脅, 引起病變。研究表明約90%的癌癥死亡案例與CTCs擴(kuò)散有關(guān), 因此CTCs能很好地反映腫瘤的惡性程度及轉(zhuǎn)移能力等信息。由于CTCs在血液中含量極少, 每mL血液中約含有1~10個(gè)CTCs, 因此在血液中直接檢測(cè)CTCs極具挑戰(zhàn)。

20世紀(jì)90年代, Manz等提出了微流控芯片技術(shù), 其是通過多學(xué)科交叉將化學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域所涉及的樣品預(yù)處理、生化反應(yīng)、分選及檢測(cè)等過程集成到幾平方厘米的芯片上, 從而實(shí)現(xiàn)從樣品前處理到后續(xù)分析的微型化、自動(dòng)化、集成化和便攜化的技術(shù)。由于微流控芯片的通道在尺寸上與細(xì)胞相匹配, 在細(xì)胞分選上顯示出了巨大的應(yīng)用潛力。近些年來, 有越來越多的研究者將該技術(shù)應(yīng)用到CTCs的分選上。根據(jù)分選原理, 微流控芯片有基于癌細(xì)胞與正常細(xì)胞或血細(xì)胞間生物學(xué)性質(zhì)(包括細(xì)胞表面蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞活性和侵潤(rùn)能力等)和它們之間物理性質(zhì)(包括尺寸、密度、細(xì)胞表面電荷量和變形性等)差異的兩大類CTCs分選方法。隨著研究的深入和技術(shù)的成熟, 不斷有研究者探索微流控芯片細(xì)胞分選方法在臨床實(shí)際樣品中的應(yīng)用, 但目前未見從實(shí)際分選CTCs角度的文獻(xiàn)綜述報(bào)道。為此, 本文擬從化學(xué)和物理差異兩方面綜述微流控芯片CTCs分選法在臨床樣品中的研究進(jìn)展。

1. 化學(xué)性質(zhì)差異(親和性分選)

親和性分選是微流控芯片細(xì)胞分選中最經(jīng)典的方法, 通過在芯片內(nèi)部的微結(jié)構(gòu)上固定能與目標(biāo)細(xì)胞結(jié)合的特定的抗體或配體, 當(dāng)樣品流經(jīng)微通道時(shí), 固定在微通道中的抗體通過與細(xì)胞表面抗原特異性結(jié)合將CTCs捕獲并保留在芯片內(nèi), 其他細(xì)胞隨緩沖液流出芯片。常用的CTCs捕獲抗體有人上皮細(xì)胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)和白細(xì)胞共同抗原CD45。親和性分選包括兩種捕獲方式, 一種是直接特異性地捕獲目標(biāo)細(xì)胞, 稱為陽性分選法; 另一種是捕獲并棄除非目標(biāo)細(xì)胞, 被稱為陰性分選法。

1.1 陽性分選法

傳統(tǒng)的親和性分選方法是直接將抗體結(jié)合在微流控芯片通道內(nèi), 但由于樣品在芯片中多處于層流狀態(tài), 只有貼近管壁的細(xì)胞可以和抗體接觸從而被捕獲, 分選效率相對(duì)較低。針對(duì)此問題, 學(xué)者們紛紛開發(fā)了多種適用于實(shí)際樣品中CTCs檢測(cè)的微流控芯片。

Nagrath等開發(fā)了一種名為“CTC-chip”的微柱陣列微流控芯片, 將抗-EpCAM抗體固定到微柱上, 此設(shè)計(jì)增大了細(xì)胞和抗體的接觸面積。他們用此芯片對(duì)轉(zhuǎn)移性肺癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌5種癌癥共116例患者血樣進(jìn)行了檢測(cè), 在其中115例樣品中成功檢測(cè)到了CTCs, 檢出率高達(dá)99%, 分選速度可達(dá)1~2 mL/h, 純度約50%。同時(shí), 他們?cè)诓东@的癌細(xì)胞中成功檢測(cè)到了腫瘤標(biāo)記物, 并通過DNA檢測(cè)驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 結(jié)果表明此系統(tǒng)適合后續(xù)的分子分析。為了評(píng)估CTCs數(shù)量變化與腫瘤體積變化之間的關(guān)聯(lián)性, 作者還測(cè)試了9例正接受治療的3種癌癥患者不同治療時(shí)期的血樣中CTCs的含量, 結(jié)合CT掃描結(jié)果所得皮爾森相關(guān)系數(shù)為0.68(P=0.03), 說明該方法在癌癥治療效果評(píng)估中也有一定的潛力。

Stott等設(shè)計(jì)了一種由78 000個(gè)結(jié)合有抗-EpCAM抗體的微柱組成的芯片, 并配有可以多個(gè)垂直焦平面分析、多個(gè)發(fā)射光譜信號(hào)量化的數(shù)字成像系統(tǒng), 以實(shí)現(xiàn)CTCs快速準(zhǔn)確的計(jì)數(shù)。該系統(tǒng)從19例前列腺腫瘤患者腫瘤切除術(shù)前血樣中成功檢測(cè)了8例, CTCs檢測(cè)含量為38~222個(gè)/mL, 從36例轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者血樣中檢出23例, CTCs檢出含量為14~5 000個(gè)/mL。

為了進(jìn)一步增加癌細(xì)胞與微通道中捕獲抗體的結(jié)合幾率, Wang等設(shè)計(jì)了由兩個(gè)功能部分組成的芯片, 第一功能部分是在芯片頂部嵌入鋸齒狀結(jié)構(gòu), 其可使樣品呈渦旋式流經(jīng)芯片頂部, 即當(dāng)樣品流經(jīng)芯片內(nèi)部時(shí), 頂部的鋸齒形結(jié)構(gòu)可誘導(dǎo)水平流動(dòng)的液體沿鋸齒垂直流動(dòng), 增加CTCs與硅納米粒子(silicon nanoparticles, SiNP)襯底之間的接觸頻率。另一功能部分是在芯片底部設(shè)計(jì)了涂覆抗-EpCAM的硅納米柱結(jié)構(gòu), 該結(jié)構(gòu)可增大細(xì)胞與捕獲抗體的接觸面積。他們用此芯片分析了26例處于不同癌癥階段的前列腺癌患者的外周血樣, 分選速度為1 mL/h, 并將分析結(jié)果與CellSearch的分析結(jié)果對(duì)比, 發(fā)現(xiàn):芯片處理1 mL樣品時(shí)的捕獲量與用美國食品藥品監(jiān)督管理局唯一認(rèn)證的CellSearch的方法處理7.5 mL樣品所獲得的捕獲量相當(dāng), 該結(jié)果證明了該芯片有更高的捕獲效率。

同樣基于增加捕獲抗體與細(xì)胞的接觸頻率的思路, Lu等研發(fā)了一種名為NanoVelcro的芯片系統(tǒng), 該芯片不同于Wang等的硅納米柱設(shè)計(jì), 其在芯片底部布滿硅制納米線以增加捕獲抗體與CTCs的接觸概率。該系統(tǒng)測(cè)試了40例前列腺癌癥患者和12例健康志愿者的血樣, 其中, 患者血液中CTCs的檢出含量為1~99個(gè)CTCs/mL, 健康人血液中循環(huán)上皮細(xì)胞(circulating epithelial cells, CECs)的檢出含量為0~2個(gè)CECs/mL, 分選速度為0.5~1 mL/h, 證明NanoVelcro芯片有強(qiáng)大的CTCs捕獲效率, 可以有效避免CellSearch方法對(duì)大部分晚期前列腺癌癥患者樣品假陰性的問題。鑒于捕獲的細(xì)胞均保有細(xì)胞活性, 如果芯片集成其他檢測(cè)技術(shù), 如基因組、轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)組分析模塊, 則可獲得捕獲細(xì)胞準(zhǔn)確的分子信息。

在化學(xué)親和分選方法中, 較高流速會(huì)影響抗原-抗體的吸附作用, 因此分選速度一般較低。為了提高芯片系統(tǒng)的分選速度, Hughes等將埃洛石納米管集成在芯片內(nèi)壁, 納米管上固定有E-選擇素和抗-EpCAM, 其中E-選擇素可以捕獲快速移動(dòng)的CTCs, 而抗-EpCAM可以特異性的捕獲CTCs。納米管既可以保證分選效率, 又可提高分選速度(1~4 mL/h), 這是因?yàn)?1)納米管涂層增加了捕獲表面積, 使能結(jié)合到微通道中的捕獲抗體大大增加; 2)納米管由通道壁延伸到通道內(nèi)部液體層, 該結(jié)構(gòu)使得結(jié)合在其上的E-選擇素的結(jié)合位點(diǎn)充分暴露在樣品溶液中, 增大了捕獲CTCs的概率; 3)納米管能夠抑制白細(xì)胞在微通道內(nèi)壁的黏附[18], 提高了CTCs的捕獲純度。作者用此芯片分析了乳腺癌和肺癌轉(zhuǎn)移患者的血樣, CTCs的捕獲純度可達(dá)到50%以上, 且分選后的癌細(xì)胞在培養(yǎng)條件下可以維持細(xì)胞活性15天。

大多數(shù)親和分選方法所用樣品需要將紅細(xì)胞裂解離心去除, 為了簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟, Stott等設(shè)計(jì)了一種魚骨結(jié)構(gòu)的親和分選芯片可以直接分析全血樣品, 如圖 1a所示, 魚骨結(jié)構(gòu)中固定有捕獲癌細(xì)胞的EpCAM, 魚骨結(jié)構(gòu)可將液體的流動(dòng)狀態(tài)從層流轉(zhuǎn)變?yōu)闇u流, 從而使細(xì)胞更容易與捕獲抗體接觸。該芯片易于操作, 通過集成多條微通道至芯片中形成平行陣列, 分選速度可達(dá)1 mL/h, 捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞還可用于其他檢測(cè)或細(xì)胞培養(yǎng)。Stott利用魚骨芯片對(duì)15例男性前列腺癌癥患者外周血進(jìn)行分選試驗(yàn), 結(jié)果顯示該芯片在14例血樣中成功捕獲到了CTCs。此芯片還被用于36例轉(zhuǎn)移性前列腺癌癥患者血樣中CTCs的檢測(cè), 成功檢出了23例, 并通過基因測(cè)序成功檢測(cè)到了捕獲細(xì)胞裂解液中的TMPRSS2-ERG嵌合轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。此外, 在癌癥患者血液分選過程中, 作者在芯片中觀察到了細(xì)胞群, 這可能與癌癥的轉(zhuǎn)移過程相關(guān), 而在模擬樣品(即癌細(xì)胞與正常血液的混合樣品)分析中未見此類現(xiàn)象報(bào)道, 這進(jìn)一步表明模擬樣品與真實(shí)樣品存在一定的差異。

圖 1 CTCs親和分選裝置(a)魚骨結(jié)構(gòu)微漩渦發(fā)生器、(b)抗體標(biāo)記的磁性粒子捕獲CTCs及(c)速度谷分選芯片、電化學(xué)裂解電極、納米結(jié)構(gòu)傳感器的示意圖

Sheng等對(duì)魚骨結(jié)構(gòu)進(jìn)行了優(yōu)化, 將寬度均一的魚骨槽尺寸增大到80 μm甚至120 μm。在1 mL/min的通量下, CTCs的捕獲效率提高到90%以上, 分選純度大于84%。在18例胰腺癌患者血樣中, 17例被檢出CTCs, 在健康志愿者血樣中未檢測(cè)到CTCs。

眾所周知, CTCs有諸多亞型細(xì)胞, 這進(jìn)一步增加了CTCs分選的難度, 若將可與多種細(xì)胞表面抗原結(jié)合的抗體同時(shí)應(yīng)用于CTCs分選中, 在理論上CTCs分選的靈敏度也會(huì)相應(yīng)提高。Jackson等將與急性髓性白血病白細(xì)胞相關(guān)的3個(gè)細(xì)胞表面抗原(CD33、CD34、CD117)抗體分別固定在3張芯片上, 每個(gè)芯片包含50組寬25 μm的正弦型通道, 血液分別流經(jīng)3張芯片時(shí)不同亞型的CTCs最大程度地被捕獲。在25 μL/min的通量下, CTCs的捕獲純度為88%~99%。干細(xì)胞移植后的患者血樣中CTCs監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示, 此法適用于90%以上的患者, 不存在多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)采樣頻率低和適用比例(低于50%)低的問題。

上述固載了捕獲抗體的微流控芯片技術(shù)都展示出了較好的CTCs捕獲能力, 但在釋放CTCs出微流控芯片以進(jìn)行后續(xù)分析存在較大的困難。為此, 學(xué)者們將磁性材料引入到微流控芯片CTCs分選中, 它是將可與細(xì)胞表面抗原發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體結(jié)合到磁性材料上, 將其置于樣品溶液中, 隨后引入到微流控芯片中, 施加外界磁場(chǎng), 捕獲了CTCs細(xì)胞的磁性材料可被固定于微流控芯片中并與其他細(xì)胞分離, 撤去外界磁場(chǎng)后, 可將捕獲細(xì)胞從微流控芯片中釋放出來。

Earhart等在12 μm厚的軟磁合金上制作了尺寸為40 μm×40 μm的微孔陣列, 整個(gè)芯片大小7 mm×7 mm (見圖 1b)。血樣首先與結(jié)合有抗-EpCAM的磁性納米粒子混合孵育, 樣品中的CTCs與磁性粒子結(jié)合, 當(dāng)樣品流經(jīng)處于外界磁場(chǎng)中的微孔陣列時(shí), 未結(jié)合細(xì)胞可穿過微孔, 而磁性納米粒子標(biāo)記的CTCs則被磁場(chǎng)捕獲保留在芯片內(nèi)部, 關(guān)閉外界磁場(chǎng), 低流速緩沖液沖洗芯片即可收集捕獲的CTCs。此芯片系統(tǒng)首先分析了肺癌細(xì)胞H1650和健康志愿者的全血混合樣品, 在0.9 mL/min的流速下, CTCs的捕獲率高達(dá)95.7%。隨后, 此芯片又被用于測(cè)試6例非小細(xì)胞肺癌患者和5名健康志愿者的實(shí)際全血樣品, 癌癥患者組檢測(cè)出CTCs含量為31~96個(gè)/mL, 在健康組僅檢出一個(gè)CTCs。

Saliba等提出了一種利用Ephesia技術(shù)的細(xì)胞分選方法, 將生物功能化的超順磁珠放置在微流控芯片通道中, 在適度的外場(chǎng)下(10~30 T), 偶極-偶極相互作用能克服磁珠的布朗運(yùn)動(dòng)并誘導(dǎo)磁珠鏈順磁場(chǎng)方向形成。該系統(tǒng)包括一個(gè)底層的流體運(yùn)輸通道和一個(gè)上層的與流體運(yùn)輸通道交叉的夾管閥。通過控制流速和閥門的開合可以避免液流脈沖對(duì)于磁性柱陣列穩(wěn)定性的不利影響。磁珠上結(jié)合的抗-CD19單抗可與B淋巴細(xì)胞特異性結(jié)合以達(dá)到分選的目的。作者用此芯片分析了4例慢性淋巴細(xì)胞白血病、1例套細(xì)胞淋巴瘤、2例濾泡性淋巴瘤共7例患者的血樣, 在這些樣品中均成功分選出CTCs。利用Ephesia技術(shù)中使用的功能化磁性珠可以批量生產(chǎn), 因此成本大大降低。

Autebert等同樣將Ephesia技術(shù)應(yīng)用于CTCs分選中, 并用于上皮性癌癥患者血樣分析, 在8例前列腺癌和5例乳腺癌患者血樣中分別檢測(cè)出6例和4例, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和CellSearch相當(dāng)。此外作者將血樣進(jìn)行梯度離心處理, 提高了分選純度以便于下游分析。

在利用免疫磁分選的基礎(chǔ)上, Mohamadi等利用速度谷芯片制作了一個(gè)集CTCs捕獲、裂解、mRNA電化學(xué)傳感檢測(cè)于一體的分選系統(tǒng)(見圖 1c)。芯片分為細(xì)胞捕獲裂解和mRNA檢測(cè)兩大功能部分。在第一功能區(qū)域的速度谷芯片中, X型結(jié)構(gòu)使通道中的流體產(chǎn)生速度差, CTCs會(huì)滯留在通道中液體流速小的位置, 同時(shí)EpCAM抗體功能化磁性納米粒子可與CTCs特異性結(jié)合, 通過外加磁場(chǎng)即可實(shí)現(xiàn)對(duì)CTCs的捕獲。通過在細(xì)胞捕獲芯片區(qū)域的交叉電極上施加20 V電壓可將細(xì)胞進(jìn)行電化學(xué)裂解, 檢測(cè)區(qū)域是由一系列標(biāo)記有可與靶mRNA互補(bǔ)的中性肽核酸探針的納米微電極組成, 裂解物轉(zhuǎn)移到傳感檢測(cè)區(qū)后孵育30 min, 可檢測(cè)細(xì)胞中前列腺特異性抗原的mRNA。通過對(duì)16例前列腺癌癥患者和7例健康志愿者的血樣測(cè)試及對(duì)細(xì)胞的免疫染色實(shí)驗(yàn)表明:癌癥患者血樣中CTCs的檢出含量均在15個(gè)CTCs/mL以上, 而健康志愿者血樣的檢測(cè)濃度均低于15個(gè)CTCs/mL。該系統(tǒng)在2 mL全血中的CTCs捕獲效率高達(dá)97%, 其富集效率可達(dá)500倍, 可將CellSearch分選CTCs純度提升兩個(gè)數(shù)量級(jí)。

Wang等設(shè)計(jì)了一種一步CTCs分選芯片, 該芯片可直接將CTCs從全血中分離出來。作者將免疫磁珠分離法和魚骨結(jié)構(gòu)的芯片結(jié)合, 標(biāo)記有抗EpCAM和表皮生長(zhǎng)因子受體抗體的磁珠首先與血樣混合孵育, 當(dāng)混合樣品通過魚骨結(jié)構(gòu)的芯片時(shí), 位于芯片上方的磁場(chǎng)可將CTCs捕獲并保留在芯片中, 通過移除磁場(chǎng)可將CTCs回收并進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)及下游分子分析。此方法分選回收的CTCs具有較高的生物活性且能在較小體積的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中達(dá)到細(xì)胞增殖的濃度。在35例肺腺癌患者的血樣中, 有5例成功實(shí)現(xiàn)了CTCs細(xì)胞增殖, 2例血樣中的CTCs的培養(yǎng)時(shí)間可達(dá)6個(gè)月以上。

Tang等設(shè)計(jì)了一種操作簡(jiǎn)便的免疫磁珠CTCs分選方法, 其在分選裝置中加入了包被在聚二甲基硅氧烷芯片中的鎳點(diǎn)陣列, 鎳點(diǎn)尺寸為50 μm×50 μm, 兩個(gè)相鄰鎳點(diǎn)的縱向間距為100 μm, 橫向間距為50 μm, 鎳點(diǎn)可以增強(qiáng)磁性粒子局部磁場(chǎng)且可調(diào)節(jié)磁場(chǎng)分布(調(diào)節(jié)精度可到微米級(jí)), 結(jié)合有抗-EpCAM抗體的磁性納米粒子在外加磁場(chǎng)的作用下會(huì)在芯片內(nèi)部形成均一的磁性層, 便于CTCs捕獲。細(xì)胞的回收及磁性粒子的解離僅需磷酸緩沖鹽沖洗幾分鐘, 此法操作簡(jiǎn)單且能保持細(xì)胞活性, 被作者成功用于癌癥患者血樣中CTCs分選。

光化學(xué)也可被用于免疫磁力分選CTCs中, Lv等將具有光敏特性的7-氨基香豆素作為連接抗-EpCAM抗體和磁性粒子的橋梁, 免疫磁性粒子捕獲CTCs后, 通過光照射可使7-氨基香豆素與磁性粒子解離以釋放CTCs, 此法避免了磁性粒子對(duì)回收CTCs細(xì)胞培養(yǎng)的影響。在癌細(xì)胞系與人血的混合樣品測(cè)試實(shí)驗(yàn)中, 該系統(tǒng)的CTCs分選效率可達(dá)90%, 純度約為85%。在紫外照射下, 有90%活細(xì)胞從芯片釋放, 近紅外光可到97%的釋放率。13例癌癥患者(肺癌、乳腺癌、肝癌、結(jié)腸癌)血樣中均檢測(cè)到了CTCs, 而在8例健康志愿者血樣中未檢出CTCs。

1.2 陰性分選法

腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程會(huì)引起EpCAM表達(dá)水平顯著性降低甚至喪失, 因此基于EpCAM的親和分選方法無法應(yīng)用到EpCAM弱表達(dá)或者不表達(dá)的CTCs分選中。同時(shí), 陽性分選方法也存在一些問題, 如由于癌細(xì)胞亞群不同導(dǎo)致的CTCs檢出量低、捕獲的癌細(xì)胞不易回收或在回收過程中細(xì)胞活性易受影響。

針對(duì)這些問題, 研究者們開發(fā)了多種不同的陰性分選方法。例如, Lee等設(shè)計(jì)了一種叫“μ-MixMACS”的芯片, 此芯片包括兩個(gè)功能模塊, 分別是多渦旋混合模塊和磁力細(xì)胞分選模塊。首先使用溶血緩沖液去除血樣中的紅細(xì)胞, 然后樣品在有多個(gè)弧形通道的芯片中與標(biāo)記有抗-CD45抗體的磁性納米粒子充分混合, 樣品中的白細(xì)胞與抗-CD45抗體特異性結(jié)合, 當(dāng)外界加入磁場(chǎng)時(shí), 白細(xì)胞保留在芯片中, 而其他的細(xì)胞會(huì)隨緩沖液流出而被收集。在10例乳腺癌患者血樣檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中, 該系統(tǒng)成功在5例樣品中檢出CTCs。“μ-MixMACS”芯片的分離過程無需長(zhǎng)時(shí)間的孵育且能實(shí)現(xiàn)CTCs的連續(xù)分離, 此方法不受癌細(xì)胞表面抗體表達(dá)量和細(xì)胞亞型的影響從而使CTCs的檢出量大大增加。因此, “μ-MixMACS”芯片可以用于收集各種類型CTCs。

Sajay等設(shè)計(jì)了一種兩步陰性CTCs分選平臺(tái), 首先在磁場(chǎng)的作用下利用標(biāo)記有抗-CD45抗體的磁性粒子除去血液中的白細(xì)胞, 然后樣品流經(jīng)9 μm的狹縫薄膜時(shí)尺寸較小的紅細(xì)胞、血小板等細(xì)胞通過狹縫, 而尺寸較大的CTCs保留在芯片中。為了測(cè)試該系統(tǒng)在臨床中應(yīng)用的效果, 作者測(cè)試了12例非小細(xì)胞肺癌和3例結(jié)直腸癌患者的血液樣品, 此系統(tǒng)成功檢測(cè)到所有樣品中的CTCs。此方法具有3方面優(yōu)勢(shì):1)2 mL全血樣品完成分析過程僅需60 min, 可以滿足快速分析的要求; 2)無需離心去除白細(xì)胞或加入化學(xué)試劑除去紅細(xì)胞, 免去了繁瑣的樣品前處理過程, 而且白細(xì)胞和CTCs的回收率均大于90%; 3)由于整個(gè)分析過程未加入化學(xué)試劑, 所以回收的細(xì)胞依舊保持生物活性, 可以進(jìn)一步進(jìn)行蛋白質(zhì)或核酸內(nèi)容物的分析。

2 物理性質(zhì)差異

血細(xì)胞和癌細(xì)胞存在很大的物理性質(zhì)差異, 如密度、大小、形狀和變形性以及在流場(chǎng)中的力學(xué)特性等。根據(jù)其不同的物理特點(diǎn), 通過設(shè)計(jì)不同的微結(jié)構(gòu)單元可將CTCs從血液中分離出來, 常用的微結(jié)構(gòu)包括微孔陣列、微過濾膜和微柱等。

基于物理性質(zhì)差異的分選方法不依賴細(xì)胞表面標(biāo)志物, 操作簡(jiǎn)單成本低, 且分選后收集的CTCs可以結(jié)合多種抗體進(jìn)行標(biāo)志物鑒別, 而且樣品流速大能夠?qū)崿F(xiàn)高通量分選。但在尺寸上CTCs和白細(xì)胞有重疊, 分選后的細(xì)胞中可能混有白細(xì)胞, 而且在較大的機(jī)械力作用下, CTCs流經(jīng)微孔或者濾網(wǎng)時(shí)容易破裂[36], 這會(huì)導(dǎo)致分離純度和細(xì)胞活性降低。

2.1 尺寸差異和變形性差異

2010年, Tan等利用癌細(xì)胞和血細(xì)胞在尺寸和變形性上的差異設(shè)計(jì)了一種芯片分離平臺(tái), 芯片的過濾部分是由3根呈圓弧形排布的微柱組成的陣列, 微柱間間隙5 μm, 以保證只有尺寸較大的癌細(xì)胞不能通過, 且每個(gè)過濾單元捕獲一個(gè)癌細(xì)胞, 既達(dá)到分離的目的又避免了CTCs堆積造成的堵塞。作者選用5組肺癌轉(zhuǎn)移患者的血樣對(duì)此裝置進(jìn)行了測(cè)試, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果達(dá)到了100%的檢測(cè)率和50%的捕獲率, 平均分選純度為83%。此裝置的優(yōu)點(diǎn)是樣品不需要預(yù)處理而且完成細(xì)胞的分選僅需一步, 該系統(tǒng)可以直接回收活性癌細(xì)胞以便下游分析。

Lv等設(shè)計(jì)了一種具有高純、高效優(yōu)點(diǎn)的間距遞減的CTCs分選芯片。該芯片由過濾和捕獲兩部分組成, 過濾部分由間距為50 μm的微柱陣列組成, 可以減少細(xì)胞堵塞; 捕獲部分由間距從12 μm到4 μm遞減的10列微柱組成, 尺寸較小且變形性高的血細(xì)胞可通過間距較小的微柱進(jìn)入廢液槽, 而尺寸較大的腫瘤細(xì)胞和部分白細(xì)胞則進(jìn)入旁側(cè)回收槽。該裝置的CTCs的分選效率大于90%, 純度約為90%。作者通過裂解將紅細(xì)胞除去可以很大程度地提高分選速度并可以減輕細(xì)胞堵塞的影響。此芯片在取樣的10例肝癌患者血樣中均檢測(cè)到CTCs。

聚對(duì)二甲苯(Parylene)是一種具有較好生物相容性的材料。2010年, Lin等[40]采用Parylene微孔薄膜設(shè)計(jì)了一種CTCs分選芯片, 為了比較此芯片與CellSearch在檢測(cè)靈敏度上的差異, 作者將10個(gè)培養(yǎng)的癌細(xì)胞混入10 mL健康志愿者的血樣中, 取7.5 mL作為分選樣品, 每個(gè)裝置測(cè)試5組樣品, 其中, 該系統(tǒng)在5組樣品中均至少檢測(cè)到1個(gè)CTCs, 而CellSearch僅在3組樣品中檢測(cè)到CTCs。之后, 他們利用此裝置和CellSearch分別測(cè)定57例癌癥患者血液樣品, 其中微孔薄膜分選系統(tǒng)可以確定的有51例, 而CellSearch僅能確定26例。由此可以看出微孔薄膜分選系統(tǒng)較CellSearch有更高的檢測(cè)靈敏度, 且由于Parylene具有很好的透光性, 該系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)在顯微鏡上直接觀察芯片中的細(xì)胞。

2012年, Lim等同樣利用癌細(xì)胞和血細(xì)胞在大小和變形性上的差異, 使用有105個(gè)密集孔陣列的硅材料快速分析了血液中的CTCs, 陣列中孔直徑為10 μm, 孔間距為15 μm。在對(duì)人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)和人肝癌細(xì)胞(HepG2)與血液的混合樣品測(cè)試時(shí)得到了大于80%的回收率, 為了進(jìn)一步驗(yàn)證此芯片在實(shí)際樣品測(cè)試中的可行性, 作者又用8例癌癥患者的血樣作為樣品進(jìn)行分析, 該芯片成功地檢測(cè)到CTCs, 從進(jìn)樣到得到測(cè)試結(jié)果僅需要1.5 h。由于Lim將芯片嵌合入熒光顯微鏡中, 因此該芯片實(shí)現(xiàn)了集CTCs捕獲、計(jì)數(shù)、鑒定、免疫熒光染色的一體化。

2013年, Hosokawa等依據(jù)細(xì)胞間尺寸的差異設(shè)計(jì)了特定的微腔大小和幾何結(jié)構(gòu)以分選CTCs。該系統(tǒng)的核心結(jié)構(gòu)由104個(gè)直徑為8~9 μm的微腔陣列組成, 樣品通過蠕動(dòng)泵進(jìn)入芯片, 尺寸較小的血細(xì)胞通過微腔隨緩沖液流出, 尺寸較大的腫瘤細(xì)胞則由于負(fù)壓作用被固定在圓孔上。該芯片測(cè)試了8種癌細(xì)胞與健康人血液的混合樣品, 其分離效率高達(dá)97%, 遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于同一實(shí)驗(yàn)樣本采用CellSearch系統(tǒng)的分選效率, 并且細(xì)胞活性不會(huì)被破壞。在臨床試驗(yàn)中, 作者用微腔陣列和CellSearch兩種方法分別對(duì)22例非小細(xì)胞肺癌和21例小細(xì)胞肺癌患者樣品進(jìn)行檢測(cè), 該系統(tǒng)的檢出率高達(dá)77%和95%, 而CellSearch的檢出率僅為32%和57%, 兩者在7.5 mL血樣中檢出CTCs的量分別為2~2 329個(gè)和0~325個(gè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明微腔陣列分選芯片較CellSearch有更高的CTCs檢測(cè)靈敏度。

分選芯片復(fù)雜的制作步驟和昂貴的制作成本限制了其在臨床中的應(yīng)用, 因此很有必要開發(fā)一種簡(jiǎn)單、可靠、價(jià)格低廉的芯片。Huang等[43]設(shè)計(jì)了一種基于細(xì)胞尺寸差異的過濾式分選芯片。該芯片由86對(duì)互相平行的主通道和旁通道組成, 主通道和旁通道中間隔有分離通道, 主通道寬50 μm, 深50 μm, 分離通道寬20 μm, 深2~8 μm。主通道的一端直接與進(jìn)樣口相連, 另一端則被封閉。細(xì)胞進(jìn)入芯片主通道時(shí), 尺寸較小的血細(xì)胞可以通過分離通道進(jìn)入旁通道進(jìn)而在廢液池被收集, 而尺寸較大的癌細(xì)胞則被保留在主通道內(nèi)。此芯片的制作非常簡(jiǎn)單, 僅需要將模塑成型的聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane, PDMS)黏合在玻璃基片上, 在芯片的進(jìn)樣口連接一個(gè)注射泵即可。使用該芯片在60例肺癌患者血樣中成功檢出58例, CTCs平均檢測(cè)含量為18.6個(gè)/mL。該芯片具有制作簡(jiǎn)單成本低、實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單易行且結(jié)果真實(shí)可靠的優(yōu)點(diǎn)。

Adams等將孔徑為7 μm的CellSieveTM過濾芯片用于CTCs分選。如圖 2所示, 一次性的CellSieveTM過濾芯片置于支撐槽中, 血樣樣品由裝置上部加入并流經(jīng)過濾芯片時(shí)尺寸較大的CTCs保留在芯片中, 其他細(xì)胞隨緩沖液進(jìn)入注射器中, 分選過程結(jié)束后將含有細(xì)胞廢液的注射器換成裝有磷酸鹽緩沖液的注射器, 并將此裝置反轉(zhuǎn), 手動(dòng)將緩沖液推入支撐槽中即可實(shí)現(xiàn)CTCs回收。作者選用10例乳腺癌和6例前列腺癌患者血樣進(jìn)行測(cè)試, 此裝置不僅可以成功分選出CTCs并且可以完成細(xì)胞原位鑒定及細(xì)胞回收相關(guān)實(shí)驗(yàn)。CellSieveTM過濾芯片無自發(fā)性熒光且有生物惰性, 因此可以實(shí)現(xiàn)捕獲細(xì)胞的原位免疫熒光染色鑒別和細(xì)胞培養(yǎng)。此裝置集CTCs捕獲、培養(yǎng)、鑒定、多種分子水平分析于一體, 結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單, 分選過程無需對(duì)血樣進(jìn)行前處理, 可以滿足商業(yè)化、臨床化的要求。

圖 2 一次性Parsortix盒整體及截面結(jié)構(gòu)示意圖

Chudziak等將Parsortix系統(tǒng)的CTCs分選和血漿中游離循環(huán)DNA檢測(cè)結(jié)合, 如圖 2所示, 一次性的Parsortix芯片中有多個(gè)并列的寬度呈階梯狀遞減的通道, 通道最窄處10 μm, 由于CTCs較大的尺寸及不易變形的特性, CTCs被保留在通道的最窄處, 通過反方向沖洗芯片即可回收CTCs, 離心獲得血漿中的游離循環(huán)DNA由核酸檢測(cè)試劑盒檢測(cè)。將此方法與CellSearch方法同時(shí)對(duì)12例肺癌患者樣品測(cè)試, 此方法在全部血樣中均檢測(cè)出CTCs, 而CellSearch檢出10例。此方法的優(yōu)勢(shì)在于:分選系統(tǒng)適用于室溫存放4天之久的全血樣品而且將CTCs芯片分選與血漿中游離循環(huán)DNA檢測(cè)結(jié)合, 獲取的CTCs信息更加全面。

2.2 力學(xué)性質(zhì)差異

慣性分選也被用于CTCs檢測(cè), 其原理是芯片中的粒子受到慣性遷移和彎流道中的二次流效應(yīng)的影響, 在特定雷諾數(shù)條件下遷移至特定的平衡位置, 形成聚焦流動(dòng), 從而實(shí)現(xiàn)不同種類細(xì)胞的分選。通常慣性分選采用的流速較高, 雷諾數(shù)在100左右, 且分選通道可平行集成, 因而具有較高的通量。

Sollier等設(shè)計(jì)了一種具有8列并聯(lián)管道, 每個(gè)管道含8個(gè)縮擴(kuò)單元的高通量分選芯片, 其中壓縮單元寬40 μm, 擴(kuò)張儲(chǔ)液槽寬480 μm、長(zhǎng)720 μm?？s擴(kuò)結(jié)構(gòu)中的慣性升力和流道結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)產(chǎn)生的渦流將不同細(xì)胞置于不同的平衡位置, 直徑較大的癌細(xì)胞受較大的梯度剪切升力遠(yuǎn)離管道中心, 保留在擴(kuò)張儲(chǔ)液槽中, 而直徑較小的血細(xì)胞則留在主流體中隨液體流出芯片, 通過減低流速削弱渦流的作用可收集保留在芯片中的CTCs。在4 mL/min的高通量下, 該芯片分離癌細(xì)胞和健康人血液混合樣品的效率可達(dá)85%。同時(shí), 作者用該系統(tǒng)檢測(cè)了12例乳腺癌和小細(xì)胞肺癌病人的血液樣本, 其中9例被成功檢出。

Hyun等同樣將縮擴(kuò)結(jié)構(gòu)用于細(xì)胞分選, 4組縮擴(kuò)結(jié)構(gòu)平行集成在一張芯片上, 通道中的收縮單元寬60 μm、長(zhǎng)150 μm, 擴(kuò)張單元寬300 μm、長(zhǎng)300 μm, 通道深度為60 μm, 每組微通道末端有3個(gè)收集口, 位于通道中間的出口收集癌細(xì)胞, 兩側(cè)的出口收集白細(xì)胞等。在樣品進(jìn)口和收集口分別安裝一個(gè)注射泵以使液體在微通道中連續(xù)且穩(wěn)定的流動(dòng)。為了避免在樣品處理過程中產(chǎn)生的異質(zhì)碎片堵塞通道, 作者在分離通道的前面加了一個(gè)過濾器, 過濾器的加入不僅可以除去樣品中的碎片同時(shí)增加了芯片的使用壽命。他們分別分析了MCF-7與白細(xì)胞混合樣品和MDA-MB-231與白細(xì)胞混合樣品, 兩種癌細(xì)胞分選率分別為94%和92%。該系統(tǒng)又被用于檢測(cè)24例轉(zhuǎn)移乳腺癌患者的血液樣品, 其中有19例樣品成功檢測(cè)到了CTCs。為了鑒定回收的CTCs, 作者分別檢測(cè)了癌癥細(xì)胞特征蛋白和DNA, 發(fā)現(xiàn)細(xì)胞角蛋白陽性、細(xì)胞表面CD45陰性和DNA陽性, 結(jié)果表明此芯片可以成功地將CTCs和白細(xì)胞分離。但分離微通道的平行化集成導(dǎo)致出口太多, 不便于操作, 并且此方法每次取樣量為7.5 mL, CTCs檢出數(shù)量?jī)H為0~21個(gè), 該分選系統(tǒng)的檢測(cè)靈敏度較低。

在螺旋通道內(nèi)的細(xì)胞會(huì)受到慣性升力和Dean拽力的共同作用而聚焦在不同平衡位置, Warkiani等利用此原理設(shè)計(jì)了一種梯形截面螺旋通道芯片, 相對(duì)常見的矩形截面而言, 梯形截面能拉大平衡時(shí)尺寸不同細(xì)胞的距離, 在細(xì)胞分選純度上更有優(yōu)勢(shì), 此裝置通量可達(dá)1.7 mL/min, CTCs回收率高于80%, 10例轉(zhuǎn)移性乳腺癌和肺癌患者樣品中均被檢測(cè)到了CTCs, CTCs檢出含量為3~125個(gè)/mL。

同樣基于慣性分選原理, Khoo等設(shè)計(jì)了一種由3組并聯(lián)螺旋通道組成的微流控芯片分選系統(tǒng), 該系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了大于7.5 mL/min的超高速分選, 在56例乳腺癌和肺癌患者樣品中均檢測(cè)到了CTCs, 其中乳腺癌患者血樣的CTCs檢出含量為12~1 275個(gè)/mL, 乳腺癌患者血樣的CTCs檢出含量為10~1 535個(gè)/mL。但該法需要樣品進(jìn)行離心裂解除去血漿和紅細(xì)胞等前處理, 操作過程繁瑣且有可能導(dǎo)致CTCs的丟失。

3 多種技術(shù)結(jié)合

目前, 已經(jīng)報(bào)道了多種技術(shù)相結(jié)合的分選方法, Chang等將免疫磁力分選技術(shù)和尺寸過濾技術(shù)相結(jié)合分選了CTCs, 如圖 3a所示, 此系統(tǒng)由1張微孔直徑為8 μm的芯片、2個(gè)分別位于芯片頂部和底部的磁鐵組成。首先, 免疫磁性分選方法將CTCs與其他血細(xì)胞分離; 然后, 水平移動(dòng)芯片頂部的磁力較弱的磁鐵促使過量的磁性粒子從微孔流出, 從而獲取純CTCs。分析不同類型癌癥樣品時(shí), 他們將多種結(jié)合有不同抗體的磁性粒子混合使用, 50例肺癌和腺癌患者血樣中有49例被檢出CTCs, 患者在治療前后血樣中CTCs數(shù)量的變化也被成功追蹤, 結(jié)果表明:治療前后CTCs的數(shù)量確有顯著性差異, 可以作為治療效果評(píng)估的手段。在保證分選效率和純度的基礎(chǔ)上, 該系統(tǒng)分選速度可達(dá)2 mL/min, 克服了親和分選方法中速度低、CTCs不易洗脫或回收樣品中磁性粒子難以去除及物理分選方法中回收CTCs純度低的問題。

圖 3 (a)尺寸過濾+免疫磁力分選[50]和(b)確定性側(cè)向偏移+慣性+磁性分選多級(jí)分選結(jié)構(gòu)

Ozkumur等開發(fā)的名為CTC-iChip的多級(jí)微流控芯片也被用于實(shí)際樣品分析。該芯片分為3部分, 見圖 3b。首先, 樣品依據(jù)尺寸差異經(jīng)流體動(dòng)力學(xué)初選, 即全血和免疫磁珠混合樣品通過間隔32 μm的微柱陣列時(shí), 紅細(xì)胞、血小板、血漿蛋白、游離磁珠和其他血液組分被丟棄并通過頂部出口流出。隨后, 正弦型慣性微流道將白細(xì)胞和CTCs聚焦, 連接特定抗體的磁珠與相應(yīng)的細(xì)胞結(jié)合。最后, 磁場(chǎng)力將連接磁珠的細(xì)胞與其他細(xì)胞分開, 在收集口處收集CTCs。該系統(tǒng)可以根據(jù)分選細(xì)胞類型的不同選擇陽性或陰性分選模式, 分別適用于EpCAM高表達(dá)的上皮性癌細(xì)胞和EpCAM低水平表達(dá)的非上皮性癌細(xì)胞, CTC-iChip對(duì)EpCAM表達(dá)水平不同的癌細(xì)胞均有較好的捕獲效率。在8 mL/h的分析速度下, 該芯片CTCs捕獲率高達(dá)97%。作者用患者樣品測(cè)試了該系統(tǒng)的陰性模式, 成功地在41例前列腺癌患者樣品中檢出37例。同法分析了10例轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者樣品, 并對(duì)捕獲的CTCs染色, 將其與處于乳腺癌早期的細(xì)胞進(jìn)行對(duì)比, 發(fā)現(xiàn)分選獲得的CTCs與之形態(tài)相似。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:CTC-iChip是一種不完全依賴腫瘤細(xì)胞膜抗原的、無偏的、廣泛適用的且高通量的分選系統(tǒng)。

4 結(jié)論與展望

微流控芯片具有體積小、通量高、操作簡(jiǎn)便、樣品和試劑消耗量少、便于集成多種分析檢測(cè)模塊等優(yōu)點(diǎn), 使其在細(xì)胞分選方面具有一定的優(yōu)勢(shì), 本文總結(jié)了近些年已經(jīng)用于臨床樣品中CTCs分選捕獲的微流控芯片系統(tǒng), 可以看出這些方法均可分選實(shí)際樣品中的CTCs, 具有較好的分選效率和收集純度。免疫親和性分選法具有特異性強(qiáng)和純度高的優(yōu)點(diǎn), 以及分選速度慢、通量低、成本高的不足, 同時(shí)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換的作用使得細(xì)胞表面抗體表達(dá)水平具有多變性[56, 57], 親和性分選方法僅適用于特異性抗體高表達(dá)的癌細(xì)胞分選?；谖锢聿町惖姆诌x方法實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單、易行, 不需加入抗原抗體等昂貴試劑, 成本低, 分選過程不會(huì)引起細(xì)胞表型變化, 分選出的CTCs可進(jìn)行單細(xì)胞基因組測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等下游分析, 但該法CTCs檢出量偏低, 這是由于CTCs會(huì)與白細(xì)胞黏附或相互作用, 同時(shí)因白細(xì)胞和CTCs存在一定程度的尺寸重合, 該法細(xì)胞分選純度也較低。

微流控芯片在CTCs分選中也面臨一些技術(shù)上的挑戰(zhàn), 如1)芯片通道空間小, 實(shí)驗(yàn)過程中通道容易堵塞; 2)芯片制作需要精密儀器, 故造價(jià)昂貴不利推廣; 3)在進(jìn)行細(xì)胞分選時(shí), 有些方法難以確保較高的細(xì)胞活性。

盡管如此, 不斷有新型微流控分選系統(tǒng)被成功應(yīng)用到臨床樣品CTCs分選中。目前, 該技術(shù)發(fā)展趨勢(shì)如下:

1)單一分選方法都存在不足, 同一塊芯片上多種分選技術(shù)的融合互補(bǔ)將增加分析系統(tǒng)的魯棒性;

2)細(xì)胞內(nèi)分子分析和CTCs表征有助于臨床上治療方案的選擇決策, 在芯片上集成樣品預(yù)處理、CTCs分選、細(xì)胞計(jì)數(shù)、內(nèi)容物分析等功能單元, 使CTCs分選集成化、一體化;

3)制備廉價(jià)、便攜、易于床邊實(shí)時(shí)監(jiān)控診斷的多功能微流控芯片。隨著技術(shù)的不斷完善, 我們相信微流控技術(shù)在CTCs研究中將逐漸發(fā)揮更重要的作用。（文章來自：中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所轉(zhuǎn)載僅供參考學(xué)習(xí)及傳遞有用信息，版權(quán)歸原作者所有，如侵犯權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)系刪除）

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