基于時(shí)間分辨免疫分析的冰毒檢測(cè)微流控芯片
研制了一種聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS)-多聚賴氨酸(Poly-l-lysine,PLL)玻片雜合微流控芯片,每張芯片有24條反應(yīng)通道,每條反應(yīng)通道體積僅為2.5微升,實(shí)現(xiàn)了基于時(shí)間分辨免疫分析技術(shù)的高通量冰毒(Methamphetamine,MET)定量檢測(cè)。此芯片利用PDMS和PLL對(duì)蛋白質(zhì)的吸附特性在反應(yīng)通道內(nèi)表面固定冰毒完全抗原(MET-BSA),使其與待測(cè)樣品中的冰毒抗原(MET-Ag)共同競(jìng)爭(zhēng)標(biāo)記有冰毒抗體(MET-Ab)的乳膠微球。乳膠微球表面標(biāo)記了鑭系元素,在紫外光的照射下會(huì)發(fā)出紅色熒光,根據(jù)競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)原理,冰毒濃度越高,與反應(yīng)通道內(nèi)表面冰毒完全抗原結(jié)合的乳膠微球數(shù)量越少,所發(fā)出熒光強(qiáng)度越低。本芯片的結(jié)果讀取采用紫外照射熒光成像方法,僅需對(duì)芯片拍攝熒光圖像,即可實(shí)現(xiàn)24個(gè)樣本的同時(shí)檢測(cè)分析。本方法樣品消耗量少,通量大,可以在100~3000ng/mL濃度范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)冰毒的定量檢測(cè),可用于緝毒的初步篩查,具有較好的應(yīng)用前景。
1引言
冰毒,即甲基苯丙胺,又名甲基安非他命(Methamphetamine,MET),在大部分地區(qū)已經(jīng)趕超海洛因,僅次于大麻,成為最主要的涉案毒品種類,可致人成癮,長(zhǎng)期服用會(huì)損壞服用者認(rèn)知,導(dǎo)致精神混亂、器官衰竭,不僅危害個(gè)人健康,還嚴(yán)重危害社會(huì)治安。人吸食冰毒后,約43%未降解的原藥會(huì)在尿液排泄出來(lái),在尿液中可檢出甲基安非他命、安非他命、對(duì)羥基甲基安非他命、對(duì)羥基安非他命,冰毒濫用者服用純品冰毒后,24h內(nèi)尿中冰毒濃度均超過(guò)1000ng/mL。目前,在緝毒領(lǐng)域,檢測(cè)冰毒的膠體金免疫檢測(cè)測(cè)試卡靈敏度為1000ng/mL,如果吸毒者吸食的是混合毒品,則其尿液中冰毒的含量會(huì)降低,使用膠體金測(cè)試卡可能出現(xiàn)漏檢的情況[4,5]。高效液相色譜法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析法準(zhǔn)確且重復(fù)性好,是檢測(cè)冰毒的最終確認(rèn)方法,但是檢測(cè)儀器昂貴且操作復(fù)雜,不適合初步的大量樣品篩查使用。其它毒品檢測(cè)的方法,包括化學(xué)顯色法、色譜-質(zhì)譜法、色譜-光譜法、毛細(xì)管電泳法等,比較依賴大型儀器,或難以實(shí)現(xiàn)高通量測(cè)定。因此,需要建立新的冰毒檢測(cè)方法,以滿足簡(jiǎn)單、高通量、快速的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)需求。時(shí)間分辨免疫熒光技術(shù)具有較高的分析靈敏度,微流控芯片技術(shù)易于實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)且操作簡(jiǎn)單,將兩種技術(shù)結(jié)合起來(lái)可望實(shí)現(xiàn)便捷的高通量冰毒檢測(cè)。
標(biāo)記免疫分析是標(biāo)記技術(shù)與免疫分析技術(shù)相結(jié)合的一種分析測(cè)定技術(shù),自1959年使用放射性同位素為標(biāo)記物以來(lái),各種新型標(biāo)記物不斷出現(xiàn),如以酶為標(biāo)記物的酶標(biāo)免疫分析、以膠體金為標(biāo)記物的膠體金免疫分析、以化學(xué)發(fā)光底物為標(biāo)記物的化學(xué)發(fā)光免疫分析、以電化學(xué)為基礎(chǔ)的電化學(xué)發(fā)光免疫分析,還有以鑭系稀土元素為標(biāo)記物的時(shí)間分辨熒光免疫分析(TRFIA)等。其中常用于TRFIA的元素有鑭系元素銪、釤、鋱和鏑及其螯合物,相比于傳統(tǒng)的酶、膠體金、化學(xué)發(fā)光底物等標(biāo)記物,具有較大的Stokes位移,熒光強(qiáng)度高,半衰期長(zhǎng),激發(fā)光譜較寬,而發(fā)射光譜很窄,此外,它還具有制備簡(jiǎn)便、無(wú)放射性污染、可重復(fù)激發(fā)測(cè)量等優(yōu)越性,在臨床免疫和科學(xué)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用越來(lái)越廣。我國(guó)是稀土儲(chǔ)量大國(guó),對(duì)TRFIA進(jìn)行深入研究并推廣應(yīng)用,對(duì)我國(guó)生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)的發(fā)展具有重要意義。
微流控芯片是將傳統(tǒng)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)操作集成到一張數(shù)平方厘米的芯片上,通過(guò)芯片結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)、多種功能單元的配合,實(shí)現(xiàn)試劑的操控、生化反應(yīng)的進(jìn)行以及反應(yīng)結(jié)果的檢測(cè)。聚二甲基硅氧烷(,PDMS)屬于熱固化型材料,能透過(guò)250nm以上的紫外光與可見(jiàn)光,具有加工簡(jiǎn)單、可塑性強(qiáng)、成本低廉,以及無(wú)色透明、有彈性、透氣性好、有良好的生物兼容性等優(yōu)點(diǎn)，常被用于制作微流控芯片。微流控芯片由于其消耗樣本少、成本低、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),也被應(yīng)用到了毒品檢測(cè)當(dāng)中。Andreou等在微流控芯片的通道中實(shí)現(xiàn)了鹽溶液、唾液樣本以及銀納米粒子的穩(wěn)定層流,可在幾分鐘內(nèi)檢測(cè)出唾液中冰毒的含量。Bailey研究組在玻璃微流控芯片上設(shè)計(jì)了細(xì)長(zhǎng)的毛細(xì)管通道,實(shí)現(xiàn)了微流控芯片毛細(xì)管電泳,成功地在芯片上實(shí)現(xiàn)了苯丙胺及其類似物的分離檢測(cè)。Greenwood等利用化學(xué)發(fā)光法,在一張玻璃微流控芯片上對(duì)阿托品和杜冷丁進(jìn)行了檢測(cè),檢出限分別可以達(dá)到3.8伊10-9mol/L和7.7伊10-8mol/L。上述各方法利用微流控芯片與其它技術(shù)結(jié)合的方式實(shí)現(xiàn)了毒品檢測(cè),但是操作相對(duì)復(fù)雜,通量較小,因此,需要構(gòu)建新的高通量微流控芯片方法用于毒品的檢測(cè)。
本研究制作了PDMS-多聚賴氨酸(Poly-l-lysine,PLL)玻片雜合微流控芯片,將TRFIA技術(shù)與微流控芯片技術(shù)相結(jié)合,采用競(jìng)爭(zhēng)法的原理,實(shí)現(xiàn)了冰毒的時(shí)間分辨免疫熒光檢測(cè)。每張芯片可同時(shí)檢測(cè)24個(gè)樣本。冰毒抗體偶聯(lián)在Eu標(biāo)記的聚苯乙烯乳膠微球上,在365nm紫外光激發(fā)下,標(biāo)記物可發(fā)射610nm紅色熒光,可將冰毒的濃度轉(zhuǎn)化為熒光強(qiáng)度,通過(guò)對(duì)熒光圖像進(jìn)行分析可得到樣本中冰毒濃度。此芯片實(shí)現(xiàn)了100~3000ng/mL濃度范圍內(nèi)冰毒標(biāo)準(zhǔn)品的高通量定量分析,具有較大的檢測(cè)范圍和較低的檢出限,能夠?qū)ξ臣兤繁炯昂镜幕旌隙酒返娜藛T體內(nèi)冰毒含量進(jìn)行定量檢測(cè),避免了漏檢情況的發(fā)生,對(duì)于打擊毒品犯罪、開(kāi)展禁毒戒毒工作具有重要意義。
2實(shí)驗(yàn)部分
2. 1儀器與試劑
G3P-8旋轉(zhuǎn)涂覆機(jī)；KW-4AH烤膠機(jī)；SERIES-60平行紫外曝光機(jī)；ARV-310液體混合真空攪拌機(jī)；FG-5001空氣等離子體處理機(jī)；打孔器；TGL-16G離心機(jī)；SHP-150生化培養(yǎng)箱；GelDoc2000型紫外凝膠成像系統(tǒng)；LSP02-18注射泵；濕盒。
四寸單晶硅片；光刻膠SU8-2075、SU8-3025、顯影液；異丙醇、甲苯、無(wú)水乙醇；三甲基氯硅烷；聚二甲基硅氧烷；多聚賴氨酸玻片；PBS緩沖液；無(wú)RNA酶超純水；牛血清白蛋白、Tween-20；冰毒完全抗原；冰毒標(biāo)準(zhǔn)品、標(biāo)記冰毒抗體的乳膠微球。
2.2實(shí)驗(yàn)方法
2.2.1模具的制作玻璃-PDMS芯片的制作
芯片的結(jié)構(gòu)如圖1所示,主要由通道層和其下方的PLL玻片組成。
(1) 通道層的制作首先用1mL三甲基氯硅烷滴加在模具表面,靜置10min,以利于脫模;配制25g單體與固化劑比例為10頤1的PDMS,混勻脫氣后倒在模具上,85益加熱40min,得到厚約4mm的PDMS通道層;將PDMS通道層從模具表面揭下,使用直徑1mm的打孔器,在進(jìn)樣口與出樣口處打孔,切割掉邊緣多余的PDMS,即得到芯片通道層。
(2) 通道層與PLL玻片的封接配制2g單體與固化劑比例為5頤1的PDMS,將其與甲苯按照質(zhì)量比1頤6混合均勻,將此混合液倒在干凈的硅片上,以1000r/min的速度旋轉(zhuǎn)20s。將PDMS通道層下表面進(jìn)行氧等離子體處理,將其置于均勻涂覆了甲苯-PDMS的硅片表面,隨后將沾有甲苯-PDMS混合液的PDMS通道層與PLL玻片貼合,85益加熱24h,即得到芯片。
圖1冰毒檢測(cè)微流控芯片:(A)芯片結(jié)構(gòu)示意圖;(B)芯片實(shí)物圖。Fig.1Microfluidicchipformethamphetamine(MET)detection:(A)schematicdiagramofMETdetectionchip,and(B)photoofMETdetectionchip.
2.2.3實(shí)驗(yàn)操作步驟
實(shí)驗(yàn)操作步驟如圖2所示,(1)包被MET-BSA將2.5微升200滋g/mLMET-BSA加入反應(yīng)通道,將芯片放入濕盒中,4益孵育過(guò)夜,抽出MET-BSA完全抗原后,用注射泵以5微升/min的速度加入PBST(1伊PBS+0.05%Tween-20),37益放置1h;(2)競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)用連接了MET-Ab的2.4滋g/mL乳膠微球溶液將MET-Ag梯度稀釋,取2.5微升通入反應(yīng)通道,在室溫下競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)60min,使用注射泵以5微升/min的速度用15微升PBST清洗反應(yīng)通道;
(3)成像分析使用紫外凝膠成像儀對(duì)芯片的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行成像,曝光時(shí)間為4s,得到芯片上每條反應(yīng)通道的熒光圖像,使用ImageJ軟件對(duì)每條反應(yīng)通道的平均灰度值進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析,用軟件OriginPro8.0處理數(shù)據(jù),得到檢測(cè)結(jié)果。
圖2基于時(shí)間分辨熒光免疫競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)冰毒的步驟示意圖Fig.2SchematicdiagramofMETdetectionbasedontime-resolvedcompetitivefluoroimmunoassay
3結(jié)果與討論
3. 1PDMS-PLL雜合芯片
芯片主要由兩部分組成:PDMS制作的帶有反應(yīng)通道和進(jìn)出口的通道層以及PLL玻片。芯片如圖1B所示,一張芯片上有24條反應(yīng)通道,能夠同時(shí)檢測(cè)24個(gè)樣本,也可以根據(jù)需要選擇合適數(shù)量的通道進(jìn)行檢測(cè)。每條通道寬500滋m,高280滋m,長(zhǎng)5.5mm,進(jìn)樣口與出樣口直徑1mm,可通入待測(cè)樣本的體積約為2.5微升。24條反應(yīng)通道之間相互獨(dú)立,不存在相互污染與干擾等問(wèn)題。
3.2芯片材料選擇
PDMS與PLL均具有很好的蛋白質(zhì)吸附性能。為了選擇更合適的芯片材料,分別制作了以PDMS為通道底面的PDMS-PDMS微流控芯片和以PLL玻片為通道底面的PDMS-PLL雜合微流控芯片,兩種芯片的規(guī)格一致。為了比較兩種芯片吸附MET-BSA完全抗原的能力,同時(shí)將2.5微升200滋g/mLMET-BSA完全抗原注射進(jìn)兩張芯片的反應(yīng)通道中,4益下孵育過(guò)夜,隨后加入PBST,37益放置1h,然后用MET抗體濃度為2.4滋g/mL的乳膠微球作為熒光指示劑通入包被了MET-BSA的反應(yīng)通道中,室溫下進(jìn)行免疫反應(yīng)1h,使用PBST沖洗后,在紫外凝膠成像儀中拍攝芯片的熒光圖像。熒光強(qiáng)度越強(qiáng)表示固定在通道表面的完全抗原越多。對(duì)比結(jié)果如圖3A和3B所示,兩張圖的第一行為陰性對(duì)照,用PBS配制1%BSA溶液代替MET-BSA包被通道,未觀察到熒光,表明沒(méi)有非特異性吸附,后3行為實(shí)驗(yàn)組,均觀察到熒光,并且圖2B比圖2A熒光強(qiáng)度高。統(tǒng)計(jì)圖3A與圖3B中的實(shí)驗(yàn)組熒光強(qiáng)度并繪制熒光強(qiáng)度柱狀圖,得到圖3C。由圖3C可見(jiàn),PDMS-PLL芯片熒光的灰度值高于PDMS-PDMS芯片約一倍,并且均一性也更好。 造成這一現(xiàn)象的原因是BSA的等電點(diǎn)為4.9,在pH7.4的PBS溶液中BSA帶負(fù)電,而PLL玻片帶正電,因此PDMS-PLL芯片對(duì)MET-BSA的吸附能力更強(qiáng),所以PDMS-PLL芯片產(chǎn)生熒光強(qiáng)度更高。PDMS-PLL芯片中PLL玻片是親水的,與全疏水的PDMS-PDMS芯片相比,在包被沖洗過(guò)程中更不容易產(chǎn)生氣泡,所以產(chǎn)生熒光的均一性更好。因此選用PLL玻片作為通道底面。
圖3(A)PDMS-PDMS芯片檢測(cè)MET-Ab的結(jié)果熒光圖;(B)PDMS-PLL芯片檢測(cè)MET-Ab的結(jié)果熒光圖;(C)PDMS-PDMS芯片和PDMS-PLL芯片中實(shí)驗(yàn)組熒光強(qiáng)度柱狀對(duì)比圖Fig.3(A)FluorescentimageofdetectionresultsofMET-AbonPDMS-PDMSmicrofluidicchip;(B)fluorescentimageofdetectionresultsofMET-AbonPDMS-PLLmicrofluidicchip;(C)histogramofintensitiesoffluorescenceofexperimentalgroupsinFig.3AandFig.3B
3.3乳膠微球濃度梯度檢測(cè)
本研究采用免疫競(jìng)爭(zhēng)法,因此偶聯(lián)了MET-Ab的乳膠微球的濃度是關(guān)鍵因素,其濃度越高,檢測(cè)范圍越大。優(yōu)化了乳膠微球最佳濃度,通道內(nèi)用過(guò)量的200滋g/mLMET-BSA完全抗原包被,乳膠微球從最高濃度2.4滋g/mL用PBST依次稀釋到1.68、1.20、0.72和0.24滋g/mL。從圖4A可見(jiàn),第一排的陰性對(duì)照組沒(méi)有熒光,說(shuō)明沒(méi)有非特異性吸附,隨著偶聯(lián)MET-Ab的乳膠微球的濃度升高,其它通道熒光強(qiáng)度也逐漸增強(qiáng),由圖4A可知,熒光強(qiáng)度與抗體濃度成正比,且同一濃度MET抗體的反應(yīng)通道之間的熒光強(qiáng)度相差不大,這說(shuō)明設(shè)計(jì)的PDMS-PLL芯片能夠?qū)ET-BSA均勻地固定在反應(yīng)通道內(nèi)壁,且無(wú)非特異性吸附。由圖4B可知,熒光強(qiáng)度與抗體濃度有較好的線性關(guān)系,說(shuō)明芯片可將不同濃度的抗體檢測(cè)結(jié)果很好地反映出來(lái),可用于冰毒檢測(cè)。如圖4B所示,當(dāng)乳膠微球的濃度為2.4滋g/mL時(shí),仍不能占用所有的MET-BSA位點(diǎn),因此選取最高偶聯(lián)MET-Ab的乳膠微球濃度2.4滋g/mL作為競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)中的濃度。
圖4(A)PDMS-PLL雜合芯片檢測(cè)梯度連接在乳膠微球上的MET-Ab的熒光圖;(B)對(duì)應(yīng)圖(A)的“乳膠微球-灰度值冶曲線Fig.4FluorescenceimageofdetectionofgradientMET-AbconjugatedtolatexmicrospheresonPDMS-PLLchip;(B)curveof“concentrationofMET-Abconjugatedtolatexmicrospheres-theintensityoffluorescence冶correspondingtoFig.4A
3.4冰毒的檢測(cè)
將MET-BSA包被在芯片反應(yīng)通道內(nèi)表面,樣本中的MET-Ag會(huì)與MET-BSA競(jìng)爭(zhēng)偶聯(lián)在熒光乳膠微球上的MET-Ab,因此最終反應(yīng)通道中的熒光強(qiáng)度越弱,說(shuō)明樣本中的MET-Ag含量越高。將MET-Ag標(biāo)準(zhǔn)品用2.4滋g/mL乳膠微球稀釋至3000、1000、750、500、200和100ng/mL,各取2.5微升,分別加入反應(yīng)通道,在室溫下競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)1h,隨后使用PBST沖洗反應(yīng)通道。
使用紫外凝膠成像儀獲取反應(yīng)后的芯片的熒光圖像。如圖5A所示,1~3為3組重復(fù)實(shí)驗(yàn),每組從上而下的6條通道中MET-Ag的濃度逐漸降低,隨著MET-Ag濃度降低,熒光逐漸增強(qiáng);第1列的前3行為空白對(duì)照,反應(yīng)通道內(nèi)未包被MET-BSA;第1列的后3行為陰性對(duì)照,競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)MET-Ag濃度為0。隨著MET-*Ag濃度升高,熒光強(qiáng)度減弱。使用ImageJ軟件獲取圖中每條反應(yīng)通道的熒光強(qiáng)度值,做“MET濃度-熒光強(qiáng)度冶標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖5B所示,隨著樣品中MET-Ag濃度的升高,對(duì)應(yīng)反應(yīng)通道的熒光強(qiáng)度逐漸降低。當(dāng)MET-Ag濃度為100~1000ng/mL時(shí),反應(yīng)通道中的熒光強(qiáng)度迅速下降;而MET-Ag濃度高于3000ng/mL時(shí),熒光強(qiáng)度逐漸趨于平穩(wěn)。當(dāng)通道表面修飾的MET-BSA濃度為200滋g/mL,使用乳膠微球濃度為2.4滋g/mL時(shí),PDMS-PLL芯片可在100~3000ng/mL濃度范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)冰毒的測(cè)定。
圖5(A)芯片對(duì)冰毒標(biāo)準(zhǔn)品的梯度檢測(cè)熒光圖;(B)對(duì)應(yīng)圖(A)的“冰毒標(biāo)準(zhǔn)品濃度-灰度值冶曲線Fig.5(A)FluorescentimageofgradientdetectionresultsofMET-AgonPDMS-PLLchip;(B)curveof“MET-Agconcentrationversusintensityoffluorescence冶correspondingtoFig.5A
4結(jié)論
本研究使用PDMS與PLL玻片設(shè)計(jì)并制作了一種PDMS-PLL雜合微流控芯片,并利用TRFIA原理在芯片上實(shí)現(xiàn)了對(duì)冰毒的高通量檢測(cè)。此芯片僅利用PDMS與PLL材料自身的特性即可實(shí)現(xiàn)MET-Ag的均勻包被,無(wú)需使用其它試劑反復(fù)修飾反應(yīng)通道,制作簡(jiǎn)單,成本低廉。每個(gè)反應(yīng)通道體積僅為2.5微升,所需樣本量小。每張芯片能夠在70~80min內(nèi)同時(shí)檢測(cè)24個(gè)獨(dú)立的冰毒樣本,檢測(cè)通量高,且僅需一次紫外熒光成像即可得到全部24個(gè)樣本的檢測(cè)結(jié)果,可實(shí)現(xiàn)100~3000ng/mL濃度范圍內(nèi)冰毒的定量檢測(cè),檢測(cè)靈敏度高,動(dòng)態(tài)范圍大,有望應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)毒品檢測(cè)。
（文章來(lái)源:分析化學(xué)DOI:10.11895/j.issn.0253-3820.181216作者：孫敬敬宋祺牟穎轉(zhuǎn)載僅供參考學(xué)習(xí)及傳遞有用信息，版權(quán)歸原作者所有，如侵犯權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)系刪除）