表面電性可控磁珠微流控芯片在DNA提取中的應(yīng)用
制備了表面電性可控的氨基化SiO2@Fe3O4磁性復(fù)合微球,采用激光刻蝕和熱壓鍵合的方法制作了聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)材質(zhì)的DNA固相萃取芯片,將磁珠灌注于芯片通道中,借助永磁鐵固定并控制磁珠,將磁珠芯片應(yīng)用于人類(lèi)全血中的基因組DNA提取,優(yōu)化了提取實(shí)驗(yàn)條件,并對(duì)提取產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳和PCR分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,磁珠微流控芯片成功地從全血中提取出純度較高的基因組DNA,提取效率約35%,提取液的凝膠電泳條帶與商品化試劑盒提取的基因組DNA一致,提取液可用于進(jìn)一步的PCR反應(yīng)。
1引言
固相萃取法提取DNA是利用固體物質(zhì)(如硅、玻璃、離子交換樹(shù)脂表面)與DNA分子發(fā)生共價(jià)鍵合或靜電作用等,實(shí)現(xiàn)DNA吸附。與傳統(tǒng)的熱法提取相比,固相萃取法具有操作簡(jiǎn)便、DNA降解少的優(yōu)點(diǎn),且固相萃取技術(shù)易與微流控芯片集成，有利于實(shí)現(xiàn)DNA微全分析,目前已有研究將固相萃取技術(shù)與PCR擴(kuò)增集成在微流控芯片中,實(shí)現(xiàn)全血DNA的提取與分析。
根據(jù)填充物制作方法不同,基于固相萃取的DNA提取微流控芯片可分為非填充式芯片和填充式芯片。非填充式芯片主要在刻蝕出的通道中進(jìn)行表面功能化修飾加工，這類(lèi)芯片性能穩(wěn)定,但加工過(guò)程繁瑣,加工費(fèi)用昂貴；填充式芯片是在管道中填充二氧化硅等固定相載體以實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA的提取。Tian等將硅球填充在毛細(xì)管內(nèi),以硅球?yàn)檩d體提取了DNA,實(shí)現(xiàn)了SPE法的小型化;Breadmore利用Sol-gel把硅珠固定填充到微溝道中,實(shí)現(xiàn)從血液、細(xì)菌和病毒樣品中提純DNA,這類(lèi)芯片載體更換靈活,但在芯片內(nèi)不易控制,提取過(guò)程易造成管道堵塞。二氧化硅包裹的磁性微球具有操控簡(jiǎn)單方便、機(jī)械強(qiáng)度較高、耐酸堿腐蝕、比表面積大、固定效率高和生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)，已被應(yīng)用于生物提取。Shan等對(duì)磁性納米粒子表面進(jìn)行改性,獲得pH可控的磁珠,并成功用于病毒和質(zhì)粒DNA的提取。由于磁珠的可操控性強(qiáng),在微流控芯片中有良好的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，Choi等通過(guò)磁場(chǎng)將表面固定有生物素標(biāo)記抗體的磁珠固定在芯片通道中,通過(guò)磁場(chǎng)控制,可以簡(jiǎn)單方便地引入或排出磁珠;Zhang等構(gòu)建了夾層式的磁珠固相萃取芯片,實(shí)現(xiàn)了姿-DNA的微量提取;Li等構(gòu)建了磁珠芯片,提取人類(lèi)淋巴細(xì)胞中的DNA,提取效率雖比市售試劑盒略低,但有助于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化分析。
本研究采用自制的表面電性可控的磁珠，用于微流控芯片中,充分利用氨基化超順磁納米顆粒容易在通道中固定、DNA分子與表面電性可控磁珠吸附和解吸控制簡(jiǎn)單且時(shí)間短的優(yōu)勢(shì),構(gòu)建了DNA固相萃取芯片。采用激光刻蝕方法在聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)上燒蝕出所需孔道,通過(guò)熱壓封接孔道,芯片設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單,操作方便;灌注磁珠于芯片通道中,磁珠填充操控容易,依靠磁場(chǎng)固定于通道中,提取過(guò)程自動(dòng)化程度高?？疾炝肆魉俚忍崛?shí)驗(yàn)的參數(shù),并通過(guò)對(duì)提取液進(jìn)行凝膠電泳與PCR實(shí)驗(yàn),與商業(yè)化試劑盒進(jìn)行性能對(duì)比,構(gòu)建了一種便捷的全血中基因組DNA的提取芯片。
2實(shí)驗(yàn)部分
2. 1儀器與試劑
激光儀；JVC-1000熱壓鍵合機(jī)；微量注射泵；全波長(zhǎng)紫外/可見(jiàn)光掃描分光光度計(jì)；凝膠電泳儀；凝膠成像系統(tǒng)；PCR儀；電位分析儀；2100透射電子顯微鏡。
聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA,2mm);三(羥甲基)氨基甲烷(Tris堿)、乙二胺四乙酸鈉(EDTANa2·2H2O)、無(wú)水乙醇、乙酸鈉和乙二醇(分析純);血樣為正常人血樣,由廈門(mén)大學(xué)醫(yī)院提供;血細(xì)胞裂解液、蛋白酶K；TaqDNA聚合酶;脫氧核糖核酸；瓊脂糖；50bpLadder；溴化乙錠；超純水(18.2M贅·cm)制備。TE緩沖液(10mmol/LTris-HCl,1mmol/LEDTA,pH8.0);擴(kuò)增片段包括256bp,正向引物5憶-TGCTTGTGAATTTTCTGAGACGGATG-3憶,反向引物5憶-AACAGAACTACCCTGATACTTTTCTGGA-3憶。
2.2實(shí)驗(yàn)方法
2.2.1氨基化SiO2@Fe3O4磁性復(fù)合微球制備與表征
采用水熱法和St觟ber法制備具有核殼型結(jié)構(gòu)的超順磁性SiO2@Fe3O4微球,采用氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)對(duì)SiO2@Fe3O4微球表面進(jìn)行修飾,得到表面電性可控的氨基化SiO2@Fe3O4磁性復(fù)合微球,采用透射電鏡表征磁珠形貌。取20mg磁珠分散于5mL超純水中,濃度為4微g/微L,備用,采測(cè)量磁珠(100ng/mL)在提取核酸時(shí)所用幾種溶液(吸附溶液,淋洗液,洗提液)中的Zeta電位,研究磁珠在不同溶液中的表面電性。
2.2.2芯片設(shè)計(jì)與制作
微流控芯片的通道由PMMA經(jīng)過(guò)激光刻蝕后熱壓封接而成。圖1為磁珠芯片的設(shè)計(jì)圖,圖1A為芯片俯視圖,由圖1B中的3片PMMA基片按從上到下順序熱壓封接得到。圖中的圓環(huán)為穿孔的液流口,線條為液流通道。激光儀的工作參數(shù)如表1所示。圖中上層基片中通道寬約300微m,深約200微m;底層基片中通道寬約500微m,深約200微m。
圖1磁珠芯片設(shè)計(jì)圖:(A)芯片俯視示意圖;(B)芯片各層示意圖Fig.1Designofmagneticbeadschip:(A)Overviewofchip;(B)layersofchip
表1激光儀刻蝕參數(shù)
2.2.3磁珠芯片用于DNA提取
(1) 磁珠芯片操作方法:如圖2所示,2和3接微量注射泵,7接恒流泵。工作時(shí),首先關(guān)閉6和8,磁珠由1處注入,7接恒流泵,牽引磁珠懸濁液進(jìn)入芯片,磁珠到達(dá)5處時(shí),由于5下方放置的永磁鐵的作用,磁珠停留在5中,4為圖1中2的穿孔小圓圈。待磁珠全部到達(dá)5處時(shí),關(guān)閉1和7,打開(kāi)6,微量注射泵從2處注入樣品溶液,樣品溶液流經(jīng)5時(shí),溶液中的DNA與5中的磁珠結(jié)合,其他未能結(jié)合的物質(zhì)離開(kāi)5,流出芯片,切換注入淋洗液,淋洗液將沖洗附著在磁珠表面的溶劑和其他未結(jié)合物質(zhì),并流出芯片。結(jié)束后關(guān)閉6,打開(kāi)8,利用微量注射泵從3處注入洗脫液,流經(jīng)5處時(shí),由于溶液pH值的改變使DNA從磁珠表面脫附,并隨洗脫液從8處流出,收集洗脫液,短期保存于4益,取適量洗脫液進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束,移去磁鐵,斷開(kāi)7與恒流泵的接口,1接注射泵依次用2mol/LNaOH和超純水清洗各個(gè)通道,排出芯片內(nèi)磁珠,棄去。通道清洗干凈后,芯片可重復(fù)使用。
(2) 磁珠芯片提取DNA實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化:全血提取DNA實(shí)驗(yàn)中,在20微L全血中加入200微L裂解液和2微L蛋白酶K,混勻,進(jìn)行裂解反應(yīng),裂解反應(yīng)后加入30微LNaAc-HAc(2mol/L,pH5.0)溶液,混勻。按芯片操作方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)參數(shù)按表2設(shè)置,收集洗脫液,用Nanodrop檢測(cè)洗脫液在260nm的吸收值與純度,計(jì)算磁珠芯片的提取效率。
圖2磁珠芯片圖:(A)為示意圖;(B)為實(shí)物照片1.磁珠溶液進(jìn)口;2.樣品與淋洗液進(jìn)口;3.洗提液進(jìn)口;4.雙堰;5.磁珠固定區(qū)域;6.樣品與淋洗液出口;7.磁珠出口;8.洗提液出口。Fig.2Diagramofmagneticbeadschip:(A)Sketchmapofmagneticbeadschip;(B)Physicaldrawingofmagneticbeadschip1.Magneticbeadssolutioninlet;2.Sampleandeluentinlet;3.Eluantinlet;4.Doubleweir;5.Beadsfixedarea;6.Sampleandeluentoutlet;7.Magneticbeadsoutlet;8.Eluantoutlet.
表2磁珠芯片提取DNA實(shí)驗(yàn)條件
2.2.4提取產(chǎn)物的分析
取5微L洗脫液進(jìn)行凝膠電泳(0.6%瓊脂糖,80V,50min),并與自制磁珠芯片外提取液和商品化提取試劑盒提取液進(jìn)行對(duì)比。取適量的洗脫液進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn):模板分別為磁珠芯片洗脫液、自制磁珠芯片外提取液和商品化提取試劑盒提取液,并用TE溶液進(jìn)行空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)。擴(kuò)增片段包括256bp,正向引物5憶-TGCTTGTGAATTTTCTGAGACGGATG-3憶,反向引物5憶-AACAGAACTACCCTGATACTTTTCTGGA-3憶。25微LPCR反應(yīng)體系中含有正反向引物各0.01微mol、d5微molNTP、2.5微L緩沖液(10伊)、0.25微LTaqDNA聚合酶及100ng模板。熱循環(huán)參數(shù)為:94益預(yù)變性3min;然后以94益變性30s,56益退火30s,72益延伸30s;擴(kuò)增30個(gè)循環(huán);最后72益延伸5min使反應(yīng)完全。反應(yīng)完成后,取反應(yīng)產(chǎn)物5微L在3.0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳(1伊TAE電泳緩沖液,電壓70V,50min),用凝膠成像系統(tǒng)拍攝電泳圖譜。
3結(jié)果與討論
3. 1磁珠形貌及其表面電性表征
磁珠的透射電鏡圖如圖3所示,磁珠大小約300nm。DNA提取中所用到裂解液、淋洗液與洗提液的pH值都影響氨基化磁珠的表面電性。實(shí)驗(yàn)表征了氨基化磁珠分散在各種溶液時(shí)的Zeta電位,如圖4所示,淋洗液a為2mol/LNaAc-HAc(pH5.0),樣品處理液b為:200微L裂解液+2微L蛋白酶K+30微L2mol/LNaAc-HAc(pH5.2),洗脫液c為:TE10伊(pH8.0),樣品處理對(duì)照液d為:裂解液+蛋白酶K(pH9.3)。其中a的作用是使磁珠表面電荷為正,并中和裂解液中的堿,作為提取過(guò)程中的淋洗液;b為磁珠吸附DNA分子時(shí)所處的反應(yīng)環(huán)境;c為DNA分子從磁珠表面解析時(shí)所用的洗脫液;d為b的對(duì)照實(shí)驗(yàn)所需而設(shè)計(jì)。根據(jù)氨基化磁珠的Zeta電位實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,氨基化磁珠在不同pH值的溶液中表現(xiàn)出表面電性不同.在淋洗液(醋酸緩沖溶液)和樣品處理液中,磁珠表面電荷為正,在洗脫液中磁珠表面電荷為負(fù),通過(guò)改變?nèi)芤旱膒H可以控制磁珠表面的電性而實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA的提取:低pH溶液中磁珠表面為正電性,此時(shí)溶液中若有負(fù)電性的DNA分子,則兩者由于靜電引力作用而吸附在一起,而當(dāng)溶液的pH值較高時(shí),磁珠表面的電性轉(zhuǎn)變?yōu)樨?fù)電,此時(shí),在其表面的負(fù)電性DNA分子由于靜電斥力而脫離磁珠表面。對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中芯片的流出溶液(樣品處理液、淋洗液和洗脫液)進(jìn)行DNA純度測(cè)定,分別為:樣品處理液A260/A280=1.053,淋洗液A260/A280=0.625,洗脫液為A260/A280=1.72,由此可見(jiàn),本研究構(gòu)建的表面電性可控的磁珠芯片可通過(guò)控制提取過(guò)程中溶液的pH值在液流流動(dòng)的過(guò)程中實(shí)現(xiàn)磁珠對(duì)DNA的吸附與脫附。
圖3磁珠透射電鏡圖Fig.3Transmissionelectronmicroscopy(TEM)imageofmagneticbeads
已報(bào)道的DNA萃取主要基于二氧化硅表面與DNA分子形成氫鍵或其它共價(jià)鍵的形式結(jié)合,結(jié)合和脫附時(shí)間較長(zhǎng),整個(gè)提取過(guò)程時(shí)間通常約為15~60min,具體時(shí)間與樣品提取量相關(guān),一般的樣品量少于10微L。本研究采用的氨基化磁珠與DNA分子的作用力主要為靜電作用力,吸附和脫附時(shí)間短,提取20微L全血的實(shí)驗(yàn)過(guò)程共需40min,從單位樣品的提取時(shí)間可知,本研究構(gòu)建的芯片提取DNA的速度與已報(bào)道的微流控提取芯片相比,速度較快,在微流控芯片中由于反應(yīng)體系微量化,很多反應(yīng)需在液體流動(dòng)過(guò)程中進(jìn)行,因此反應(yīng)速度快的體系在實(shí)際應(yīng)用中具有更好的優(yōu)勢(shì)。
圖4磁珠在不同溶液中的Zeta電位a,淋洗液;b,樣品吸附溶液;c,洗脫液;d,樣品對(duì)照液Fig.4Zetapotentialofmagneticbeadsindifferentsolutionsa,Eluent;b,sampleadsorptionsolution;c,desorptionsolution;d,controlsamplesolution
3.2芯片的設(shè)計(jì)
采用PMMA片制作三層式芯片,在激光刻蝕后清洗干凈,通過(guò)熱壓鍵合機(jī)快速鍵合,相比硅片芯片,操作環(huán)節(jié)簡(jiǎn)便易操作,且對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境和儀器條件要求低;同時(shí)避免了硅羥基對(duì)磁珠的共價(jià)鍵合作用。
芯片為三層結(jié)構(gòu),在中間一層的穿孔相當(dāng)于芯片的雙堰結(jié)構(gòu),主要是為使液流在此形成渦流,達(dá)到攪拌溶液的作用,從而使溶液中的DNA更充分接觸磁珠。同時(shí)緩沖從1處(圖2)流過(guò)來(lái)的液流,防止磁珠堆積。磁珠通過(guò)磁鐵固定在提取區(qū)域設(shè)計(jì)成寬扁結(jié)構(gòu)(寬約500微m,深約200微m),扁平結(jié)構(gòu)可使磁珠平鋪分散在分離通道中,有利于DNA分子與磁珠接觸。寬度過(guò)大易導(dǎo)致磁珠分布不均,因此選擇比其它通道(300微m)略寬作為扁平分離通道的寬度。
3.3磁珠芯片的DNA提取
3.3.1DNA提取條件的選擇和優(yōu)化
在磁珠芯片中,各溶液分階段持續(xù)流經(jīng)萃取區(qū)域,與磁珠進(jìn)行充分接觸,從而實(shí)現(xiàn)溶液中的DNA分子與磁珠吸附與解吸附。Cady等在芯片外的磁珠實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)對(duì)提取過(guò)程的磁珠的飽和用量和各溶液組成及其pH進(jìn)行了探討,本研究芯片上提取DNA基于芯片外實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ),選擇磁珠用量為20微L磁珠懸濁液(4微g/微L),在室溫(20益)下進(jìn)行。由于流速直接決定了DNA分子與磁珠的吸附和解吸附時(shí)間,從而影響提取效率,吸附和解吸過(guò)程中,流速越低,萃取效率越高,因此,重點(diǎn)進(jìn)行了芯片流速的優(yōu)化。由圖5可知,吸附過(guò)程中,流速越大,DNA提取率越低,主要是因?yàn)榱魉俅?DNA分子與磁珠表面未充分結(jié)合就被液流帶出磁珠固定區(qū)域而使提取得率降低,5微L/min與10微L/min的流速時(shí),提取效率接近,為了節(jié)省反應(yīng)時(shí)間,選擇10微L/min作為吸附過(guò)程的流速。在洗脫過(guò)程中,流速越大,提取效率也越低,主要原因是流速太大,使得磁珠的表面電性轉(zhuǎn)變時(shí)間不夠,而導(dǎo)致DNA分子未能及時(shí)地從磁珠表面解吸,而使提取得率降低。由于洗脫液體積較少對(duì)實(shí)驗(yàn)時(shí)間影響較小,因此選擇5微L/min作為洗脫液的流速。在淋洗過(guò)程中,流速在20微L/min時(shí),提取效率較高,因此選擇20微L/min作為淋洗液的流速。
圖5吸附、淋洗和解吸流速對(duì)DNA提取率的影響Fig.5Effectofadsorption,elutionanddesorptionflowrateonDNAextractionrate
3.3.2全血中DNA的提取效率
將磁珠芯片用于人全血中DNA的提取,運(yùn)用NanoDrop-1000分光光度計(jì)分析DNA的濃度與純度,每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后排除磁珠,清洗后的芯片可重復(fù)使用,表3為5次重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果,通過(guò)C=50伊A260換算求得洗脫液的DNA濃度,計(jì)算洗提液(20微L)中的DNA總量,除以理論總量即可得提取率。成人新鮮血液中DNA含量約為30~60ng/微L[9],限于實(shí)驗(yàn)條件,假設(shè)實(shí)驗(yàn)用血的DNA濃度為最高含量60ng/微L,則20微L全血中的DNA約為1.2微g,最終求算DNA的平均提取率為34.7%。DNA純度以A260/A280值為參照,提取的DNA溶液的A260/A280平均值為1.74(表3),所得DNA純度較高。
芯片上DNA平均提取率為34.7%,與Zhang等報(bào)道的磁珠芯片用于姿-DNA提取率(50%)相比,提取效率略低。這是由于提取的目標(biāo)DNA不同,并且本研究的提取芯片提取的DNA總量較大,導(dǎo)致提取效率降低。芯片上的全血中基因組DNA提取率比芯片外磁珠直接提取操作(提取率約70%)低，推測(cè)因?yàn)樵谛酒写胖楸仨毻ㄟ^(guò)磁鐵固定在通道中,無(wú)法完全充分分散,與芯片外的提取過(guò)程中吸打混勻相比,磁珠與DNA分子接觸吸附的幾率更低。由于DNA分子是在溶液流動(dòng)過(guò)程中與磁珠接觸并發(fā)生靜電作用,因此與芯片外的靜止接觸相比,DNA分子更難以吸附到磁珠表面。洗提液的純度與磁珠的芯片外實(shí)驗(yàn)(A260/A280抑1.81)相比也有所下降,主要因?yàn)樵谛酒馓崛?shí)驗(yàn)過(guò)程中,通過(guò)移液槍吸打淋洗溶液,物理吸附在磁珠表面和DNA分子表面的蛋白質(zhì)由于吸打的外力而脫離磁珠,使得提取液中蛋白質(zhì)含量更低,DNA純度較高;在芯片中實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,淋洗時(shí)磁珠通過(guò)磁鐵固定平鋪在通道中,通過(guò)物理吸附磁珠和DNA分子表面的部分蛋白質(zhì),在淋洗環(huán)節(jié)中,由于液流沖力較磁珠外實(shí)驗(yàn)吸打操作的外力小,蛋白質(zhì)較難從磁珠和DNA分子表面脫落,從而使得提取液中蛋白質(zhì)含量較芯片外實(shí)驗(yàn)高,DNA純度有所下降。為驗(yàn)證提取的DNA無(wú)損傷或純度是否能滿(mǎn)足進(jìn)一步的PCR分析,進(jìn)一步對(duì)提取液的DNA進(jìn)行凝膠電泳和PCR實(shí)驗(yàn)。
表3人全血中基因組DNA提取實(shí)驗(yàn)結(jié)果
3.3.3磁珠芯片提取DNA的凝膠電泳與PCR擴(kuò)增
圖6為洗提液的凝膠電泳圖(圖6A)與PCR產(chǎn)物電泳圖(圖6B)。圖6A中的0、1、2、3分別為空白、商品化基因組DNA提取試劑盒提取液、自制磁珠芯片提取液、自制磁珠芯片外提取液的電泳條帶。凝膠電泳結(jié)果表明,DNA提取試劑盒提取液、自制磁珠芯片提取液、自制磁珠芯片外提取液的電泳條帶基本一致,表明磁珠芯片成功地實(shí)現(xiàn)了從全血中提取獲得基因組DNA,過(guò)程中未發(fā)生損傷。提取液的PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,磁珠芯片洗提液的PCR產(chǎn)物與其它兩個(gè)PCR產(chǎn)物一致。上述結(jié)果表明,本研究制備的的基于表面電性可控的磁珠技術(shù)的DNA提取芯片可用于提取全血中的基因組DNA,提取液可直接用于進(jìn)一步的PCR反應(yīng)。
圖6提取液(A)及其PCR產(chǎn)物(B)的凝膠電泳圖0.空白;1.商品化DNAkit提取的基因組DNA;2.磁珠芯片提取的DNA;3.自制磁珠在芯片外提取的DNA;4.DNAmarkerFig.6Gelelectrophoretogramsof(A)eluentand(B)PCRproducts0.Blank;1.GenomicDNAbycommerciallyDNAkit;2.Eluentbymagneticbeadsinchip;3.Eluentbymagneticbeadsoutofchip;M.50bpmarker
4結(jié)論
芯片上的DNA提取對(duì)微全分析具有重要作用。本研究將自制的表面電性可控的磁珠應(yīng)用于PMMA提取芯片中,磁珠借助外磁場(chǎng)固定于微通道中,利用此芯片成功實(shí)現(xiàn)了人全血中基因組DNA的無(wú)損提取,洗提液可直接用于進(jìn)一步PCR反應(yīng)。此磁珠芯片制作簡(jiǎn)單,操作方便,自動(dòng)化程度較高,便于與PCR芯片連接,實(shí)現(xiàn)從樣品到檢測(cè)結(jié)果的微全分析。
（文章來(lái)源:分析化學(xué)DOI:10.11895/j.issn.0253-3820.171318作者：黃華斌 傅奇 胡佳等 轉(zhuǎn)載僅供參考學(xué)習(xí)及傳遞有用信息，版權(quán)歸原作者所有，如侵犯權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)系刪除）