微流控技術(shù)在精子優(yōu)選中的應(yīng)用
傳統(tǒng)精子優(yōu)選方法包括上游法、密度梯度離心法，主要根據(jù)沉降和遷移速度選擇活力和形態(tài)正常的精子，與體內(nèi)重重篩選機(jī)制相差較大，且分選時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、離心操作過(guò)多易導(dǎo)致精子DNA過(guò)氧化損傷和斷裂，精子質(zhì)量降低，影響ART成功率。因此，建立簡(jiǎn)單、快速、無(wú)/低損傷的精子優(yōu)選新方法已成為提高輔助生殖技術(shù)(ART)成功率的迫切需求。微流控技術(shù)的應(yīng)用正適應(yīng)了這一需求，穩(wěn)定的流體環(huán)境可最大程度地避免精子機(jī)械損傷。
臨床上精子優(yōu)選主要依賴(lài)于精子活力和形態(tài)兩項(xiàng)指標(biāo)。目前微流控技術(shù)進(jìn)行精子活力評(píng)價(jià)與篩選的方法有微通道篩選、介電電泳力篩選及層流效應(yīng)篩選。
微通道篩選是通過(guò)形成穩(wěn)定流體，使精子在流體中自由游動(dòng)，不涉及過(guò)多的人為操作，故非常直接且減少/避免DNA機(jī)械損傷。
國(guó)外團(tuán)隊(duì)曾設(shè)計(jì)單一直通道、分枝級(jí)聯(lián)通道、存在障礙物的通道等系列芯片對(duì)人精子計(jì)數(shù)及活力測(cè)定。結(jié)果顯示，精子朝一個(gè)方向游動(dòng)且能穿越寬40、100、120 um的單一直通道，高活力精子能穿越較長(zhǎng)通道，精子亦可通過(guò)分枝級(jí)聯(lián)的彎曲通道。同時(shí)他們進(jìn)行了精子功能測(cè)定，如穿透宮頸粘液，與透明質(zhì)酸、殺精劑和抗人IgG抗體的作用等，證明微流控技術(shù)評(píng)價(jià)精子功能的有效性和多面性。他們通過(guò)改進(jìn)芯片結(jié)構(gòu)，進(jìn)樣池經(jīng)2條或4條彎曲通道與收集池連接，通過(guò)精子到達(dá)收集池的時(shí)間判斷精子活性，實(shí)現(xiàn)分級(jí)評(píng)價(jià)。該方法與 Makler 計(jì)數(shù)板依據(jù)精子前向運(yùn)動(dòng)分級(jí)評(píng)價(jià)結(jié)果相關(guān)性良好，高活力精子( 3 級(jí)、3+級(jí))至收集池耗時(shí)360～ 480 s，低活力精子( 1級(jí)、1+級(jí)、2級(jí)) 耗時(shí)660～770 s。該實(shí)驗(yàn)以精子評(píng)價(jià)為主，不以精子篩選為目的。
McCormack等設(shè)計(jì)直通道利用熒光標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行精液樣本受精能力篩查實(shí)驗(yàn)。參照WHO標(biāo)準(zhǔn)，活力精子濃度、前向運(yùn)動(dòng)精子濃度篩查實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該系統(tǒng)熒光信號(hào)與二者濃度皮爾遜相關(guān)系數(shù)分別是0.79、0.80，靈敏度分別是94%、96%，特異性分別是97%、90%，但該裝置價(jià)格昂貴且熒光標(biāo)記復(fù)雜，限制其廣泛應(yīng)用。
Seo等依據(jù)精子逆流游動(dòng)的特性?xún)?yōu)選公牛、小鼠、人精子。實(shí)驗(yàn)時(shí)通道A、B、C內(nèi)流體分別流向交叉點(diǎn)、儲(chǔ)液池2、儲(chǔ)液池3，儲(chǔ)液池2通入精液樣本，活力精子逆流穿越通道B到達(dá)交叉點(diǎn)，再被高速流體輸送到儲(chǔ)液池3，實(shí)現(xiàn)精子優(yōu)選。特別是該法分選3份公牛精子，精子活力由平均18.4%提高到78.8%。依據(jù)相同原理，Chen等設(shè)計(jì)一款便攜型精子質(zhì)量分析儀，該系統(tǒng)集成庫(kù)爾特技術(shù)進(jìn)行精子計(jì)數(shù)，評(píng)價(jià)精子活力及濃度兩項(xiàng)指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)證明電壓脈沖數(shù) 0～335分別對(duì)應(yīng)臨床用血球計(jì)0～19*10^6/ml、精子質(zhì)量分析儀精子活力指數(shù)0～204。本系統(tǒng)無(wú)需熒光標(biāo)記、成本低、操作方便，且無(wú)需樣本預(yù)處理，但計(jì)數(shù)孔尺寸較小 (寬6 um)。
微流控技術(shù)在精子優(yōu)選中的應(yīng)用
微流控技術(shù)在精子優(yōu)選中的應(yīng)用
Han等設(shè)計(jì)陣列微壩連接兩微室簡(jiǎn)易結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)活力精子篩選，且集成穩(wěn)定可靠的控溫模塊。結(jié)果顯示該系統(tǒng)較培養(yǎng)箱及室溫更適合精子，同時(shí)該系統(tǒng)集成倒置光學(xué)顯微鏡可用于精子評(píng)價(jià)、胚胎培養(yǎng)及體外受精(IVF)研究。
運(yùn)動(dòng)速度最快的精子未必是受精能力最強(qiáng)的精子，故精子分級(jí)捕獲及評(píng)價(jià)有利于男性不育癥的診斷及精子生理特性研究。Qiu 等設(shè)計(jì)不同通道截面實(shí)現(xiàn)各區(qū)段流速不同，在各流速區(qū)段分別捕獲與其相匹配的活力精子，統(tǒng)計(jì)各區(qū)段精子數(shù)目得到各級(jí)活力精子百分率。作者分別捕獲了平均直線(xiàn)速度( 40.5±3.0)、( 27.2±0.6) 、( 18.7±0.6) μm / s的活力精子。
直通道篩選精子簡(jiǎn)單方便，且與生理環(huán)境接近，但目前尚無(wú)公認(rèn)的尺寸標(biāo)準(zhǔn)。謝蘭以出口池精子相對(duì)數(shù)量和精子活力作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)熒光標(biāo)記精子驗(yàn)證直通道篩選效果。寬度篩選通道：長(zhǎng)7mm，深25μm，寬200μm、500μm、1mm及1. 5mm；長(zhǎng)度篩選通道：寬1mm，深25μm，長(zhǎng)5mm、7mm、1cm及1. 5cm；獲得最佳通道寬度和長(zhǎng)度，優(yōu)化通道深度： 深25μm、50μm、100μm及200μm；獲得最佳通道寬、長(zhǎng)、深，優(yōu)化篩選時(shí)間5 min、15 min、30 min及60 min。當(dāng)寬1 mm、長(zhǎng)7 mm、深25μm的直通道，經(jīng)15 min篩選的ICR小鼠精子不僅活力更高 ( 82.6±2.9 ) %且互相分散，有助于提高IVF的成功率。
微通道篩選只是單純依據(jù)精子的游動(dòng)優(yōu)選精子，不能完全反映生理狀態(tài)下精子的自然優(yōu)選過(guò)程。鐘志敏等在芯片上模擬生理狀態(tài)下精子與宮頸粘液相互作用，實(shí)現(xiàn)精子的自然優(yōu)選和精子質(zhì)量在線(xiàn)檢測(cè)。本方法用時(shí)短、無(wú)需離心，且優(yōu)選的精子在精子活力、平均軌跡速度、前向性比例、正常形態(tài)百分率等指標(biāo)均優(yōu)于分選前及上游法，同時(shí)也為芯片上模擬生理狀態(tài)下的受精過(guò)程奠定基礎(chǔ)。
微通道篩選精子簡(jiǎn)單易用，與生理環(huán)境接近，且對(duì)精子的傷害小，故其臨床應(yīng)用前景非常廣泛，同時(shí)活力篩選通道也有集成后續(xù)受精相關(guān)器件的潛力，為在芯片上實(shí)現(xiàn)IVF的全過(guò)程奠定基礎(chǔ)。
介電電泳技術(shù)(dielectrophoresis，DEP)是指細(xì)胞在不均一交變的電場(chǎng)中被誘導(dǎo)極化，不同的細(xì)胞由于介電特性、電導(dǎo)率、形狀或大小等不同而感應(yīng)出不同的偶極矩，因此在電場(chǎng)中受到不同的介電力而得以分離。
Fuhr等通過(guò)施加不同高頻電場(chǎng)實(shí)現(xiàn)不同活性的人單精子捕獲、定位和篩選。在石英和玻璃基 質(zhì)上制作超微電極，當(dāng)外界鹽溶液的電導(dǎo)率大于精 子的平均電導(dǎo)率時(shí)，負(fù)向介電電泳作用形成，精子由電極處被推向電場(chǎng)最小處。在平面4電極或三維8電極區(qū)域施加高頻交流電，形成向心推斥力，快速游動(dòng)的精子可以被捕獲數(shù)秒 (電場(chǎng)＞500V / cm、頻率MHz時(shí)，部分精子停止運(yùn)動(dòng))以便監(jiān)測(cè)；采用條狀電極及叉指電極，速度約40～70μm / s的精子將被固定在斷點(diǎn)電極處數(shù)分鐘。該系統(tǒng)亦可以將捕獲的幸存精子釋放至特定區(qū)域以便集成后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。
當(dāng)通道尺度進(jìn)入微米量級(jí)、流體雷諾數(shù)低時(shí)，相互靠近且平行的兩股層流僅靠擴(kuò)散作用實(shí)現(xiàn)混合。層流穩(wěn)定后，在表面張力和粘滯力的作用下使活力精子從原液中穿過(guò)層流界面游至收集通道中，無(wú)活力精子及細(xì)胞碎片保留在原液中流動(dòng)直至排出，從而實(shí)現(xiàn)精子活力篩選。
Cho 等集成水平式重力驅(qū)動(dòng)微泵基于層流效應(yīng)實(shí)現(xiàn)人精子篩選，克服使用傳統(tǒng)重力微泵時(shí)流速隨時(shí)間不斷降低的缺陷。3個(gè)樣本經(jīng)篩選后精子活力均接近100% ，精子正常形態(tài)率從 ( 9.5±1.1) % 提高到( 22.4±3.3 ) % ，活力精子回收率分別為39%、42%、43%。該系統(tǒng)集成度高、分選效率高，且樣品量?jī)H需50μl( 常規(guī)精子優(yōu)選方法難以操作) 。Schuster等從實(shí)踐上證明了層流效應(yīng)篩選精子的低損傷功能，但該系統(tǒng)精子回收率并不高，且篩選效率有待進(jìn)一步提高。同未處理、連續(xù)離心法、密度梯度離心法、上游法相比，Schulte等證明了層流效應(yīng)篩選的精子活力最高 (分別是52.0%、50.1%、73.4%、85.8%、96.2%，P＜0.0001)，DNA損傷率最低 (分別是13.3%、15.8%、14.9%、5.7%、1.9%，P＜0.05)。王維等考察層流原理分選的精子質(zhì)量，同上游法相比，精子DNA 損傷率明顯下降，且活力、正常形態(tài)率及尾部腫脹率均有顯著提高。后對(duì)自行設(shè)計(jì)的三通道芯片(樣品通道居兩側(cè))的通道入口角度及分選通道寬度進(jìn)行優(yōu)化。3種通道入口角度 ( 30°、45°、60°) 和3種通道寬度( 120、180、250 μm)的芯片分選的精子活力和正常形態(tài)率均無(wú)顯著差異，但入口角度30°、分選通道寬250 μm時(shí)，分選效率最高。
微流控技術(shù)在精子優(yōu)選中的應(yīng)用
Wu等采用聚乙二醇甲基丙烯酸酯表面改性聚二甲基硅氧烷( Polydimethylsiloxane，PDMS) 精子優(yōu)選芯片，親水性長(zhǎng)時(shí)間( 56 d) 穩(wěn)定，非特異性吸附極小、有效避免通道堵塞，且通道表面易浸潤(rùn)、利于進(jìn)樣，篩選的人精子活力為74%。
PDMS 因安全無(wú)保證、石英因成本高均不適合臨床應(yīng)用，Matsuura等采用臨床領(lǐng)域已認(rèn)可的環(huán)烯烴聚合物制作精子篩選芯片，經(jīng)過(guò)篩選，精子活力由53.0%提高到90%，線(xiàn)性速度由廢液池的( 21. 0±1.7)μm / s 增大至收集池的( 51.7±2.1)μm / s ( n = 172)、( 59.5±1.6 )μm /s( n = 79 )，且提高了ART成功率，但活動(dòng)精子回收率較低 ( 0.2%～0.3% )。
Tseng等采用熒光染料SYBR-14 / PI標(biāo)記人精子，通過(guò)注射泵進(jìn)樣，依據(jù)層流效應(yīng)篩選活力精子，并用顯微鏡觀(guān)察不同活力的精子，流式細(xì)胞儀鑒別及量化死/活精子。該系統(tǒng)流速可控、穩(wěn)定，且精子篩選效率提高(精子存活率94.8% )。
優(yōu)化的層流效應(yīng)精子活力篩選芯片，可有效篩選高活力精子，對(duì)于未處理的精液，尤其是含有大量碎片的精液有著極其重要的應(yīng)用價(jià)值。由于此方法不能篩選特定流速的精子，且流速限制不能篩選大量精液，同時(shí)目前此方法的應(yīng)用有限，未見(jiàn)對(duì)中重度少弱精液樣本的處理效果和在ART中的應(yīng)用效果的報(bào)道。
微流控技術(shù)優(yōu)選精子具有分選效率高、精子DNA損傷少、操作簡(jiǎn)便且分選時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)，在A(yíng)RT 中無(wú)論是IVF 和 ICSI 中精液參數(shù)正常還是輕度少弱精子癥的精子優(yōu)選都將具有良好的應(yīng)用前景。
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