自今年一月以來(lái)，新冠疫情席卷全球。截至2020年5月12日，全世界212個(gè)國(guó)家和地區(qū)共報(bào)告確診病例數(shù)4,253,802人，其中死亡病例287,250人，死亡率接近7%（注1）。本次新冠疫情對(duì)社會(huì)經(jīng)濟(jì)的沖擊是史無(wú)前例的。

隨著疫情相關(guān)信息的傳播，許多先前不為大眾所知的診斷行業(yè)專業(yè)名詞逐漸變得家喻戶曉，如核酸檢測(cè)、試劑盒、咽拭子、假陰性等等。

進(jìn)行一次新冠病毒核酸檢測(cè)的操作步驟：簡(jiǎn)言之，核酸檢測(cè)流程大體分為三步：

采樣。從人體的呼吸道或其他部位采集可能含有病毒的樣本。

提取。將病毒核酸從樣本中提取出來(lái)，與其他物質(zhì)分離。

檢測(cè)。通過(guò)熒光定量PCR法檢測(cè)提取到的病毒含量。

磁珠既為核酸提取的必備工具之一，那么，何為磁珠？如何進(jìn)行核酸提??？如何評(píng)估提取效果？

1.磁珠法核酸提取基本原理 

首先，磁珠是一類特殊的納微米材料，它們的尺寸通常在零點(diǎn)幾微米到幾微米之間，僅為一根頭發(fā)絲直徑的十幾分之一到幾十分之一，肉眼是無(wú)法觀測(cè)到單個(gè)磁珠的。

其次，它們具有超順磁性，在磁場(chǎng)中可以向一側(cè)迅速移動(dòng)，聚集在一起，而去除磁場(chǎng)后又能夠迅速恢復(fù)到分散狀態(tài)。

最后，用于核酸提取的磁珠表面具有特定的性質(zhì)，在某些條件下能夠?qū)⒉《竞怂嵛皆诒砻妫诹硪恍l件下又能將病毒核酸從表面釋放下來(lái)，用于后續(xù)的檢測(cè)步驟。

（圖1：左：MS磁珠的TEM；中：MS磁珠的SEM；右：MS磁珠在管子里無(wú)磁鐵時(shí)分散和有磁鐵時(shí)向一側(cè)聚集的圖片；說(shuō)明：納微核酸提取磁珠的電鏡圖片及其在磁場(chǎng)中的移動(dòng)）

2.如何評(píng)估磁珠法提取核酸的效果？ 

筆者個(gè)人認(rèn)為，可以按照PQR三原則法進(jìn)行評(píng)價(jià)。

P指的是Purity（純度），具體而言就是磁珠提取后的核酸中含有多少非核酸類的雜質(zhì)殘留，如蛋白、鹽、多糖等。該指標(biāo)通常用吸光度比值（A260/A280和A260/A230）來(lái)衡量。

Q指的是Quality（質(zhì)量），磁珠提取后的核酸尤其是較長(zhǎng)的基因組核酸應(yīng)保持其完整性，不應(yīng)出現(xiàn)斷裂或降解等現(xiàn)象。該指標(biāo)可通過(guò)簡(jiǎn)單的凝膠電泳或者復(fù)雜一些的特定PCR及微流控芯片（如Agilent Bioanalyzer）進(jìn)行評(píng)估。

R指的是Recovery（收率），磁珠提取過(guò)程應(yīng)當(dāng)盡量將所有的核酸都能從樣本中提取出來(lái)。高收率對(duì)于核酸檢測(cè)尤其是疾病早期檢測(cè)的靈敏度至關(guān)重要，在疾病早期，樣本中的病原體核酸含量通常較低，如果不能高效率地提取到所有核酸，那么很容易出現(xiàn)假陰性，導(dǎo)致漏檢。

3.磁珠如何與核酸結(jié)合，實(shí)現(xiàn)提取功能？ 

這就涉及到比較深入的生物化學(xué)知識(shí)。核酸作為一種生物大分子，之所以能夠在水溶液中穩(wěn)定分散不沉淀，是由于三種非共價(jià)作用力的存在：（1）靜電相互作用（2）范德華力（3）氫鍵。

核酸分子具有多個(gè)磷酸基團(tuán)，呈現(xiàn)高度負(fù)電性，分子間互相排斥從而避免發(fā)生團(tuán)聚。此外，核酸分子在水溶液中通過(guò)氫鍵與范德華力結(jié)合了大量的水分子在其周圍，形成一個(gè)水化層，也阻止了分子間的聚集。因此，要使得核酸分子結(jié)合到磁珠表面，就必須削弱上述作用力，屏蔽溶液中的靜電斥力，同時(shí)破壞核酸分子表面的水化層，使其能夠與磁珠表面相接觸，進(jìn)而產(chǎn)生吸附。

綜上所述，磁珠表面的性質(zhì)對(duì)于核酸提取至關(guān)重要。

國(guó)內(nèi)目前生產(chǎn)磁珠法核酸提取試劑盒的廠家大小百余家，所用的磁珠按照表面性質(zhì)可分為以下三類：

1.硅羥基磁珠

這是一類使用最為廣泛的磁珠。使用硅羥基磁珠提取核酸時(shí)，通常需要高濃度的離液鹽（NaI、NaClO₄、GuHCl、GuSCN等）。高濃度的鹽離子能夠有效屏蔽溶液中的靜電斥力。同時(shí)，離液鹽離子還能競(jìng)爭(zhēng)性地與磁珠表面以及核酸分子相結(jié)合，破壞二者表面原有的水化層，促進(jìn)磁珠表面與核酸分子的吸附（氫鍵+范德華力）。由于常用的離液鹽如胍基離子對(duì)PCR有抑制作用，因此它們必須在后續(xù)的洗滌步驟中被去除，去除效果可通過(guò)吸光度比值進(jìn)行監(jiān)控。

（圖2：MS050硅羥基磁珠用于質(zhì)粒DNA提取，說(shuō)明：納微MS050硅羥基磁珠提取后的DNA完整性良好，超螺旋形式的質(zhì)粒DNA最多）

（圖3：MS070硅羥基磁珠用于血清中游離DNA提取，說(shuō)明：納微MS070硅羥基磁珠可以從血清中提取游離DNA（片段長(zhǎng)度156 bp），PCR顯示平均提取效率可達(dá)85%）

2.羧基磁珠

這類磁珠除了能夠像硅羥基磁珠一樣在高濃度離液鹽環(huán)境中結(jié)合核酸分子之外，還能通過(guò)另一種特殊的機(jī)制與核酸分子結(jié)合。通過(guò)向溶液中加入一定濃度的PEG和NaCl，可以使得核酸分子從伸展的構(gòu)象逐漸蜷縮成小球狀，其上的負(fù)電荷也大部分被屏蔽掉，促使核酸分子吸附到磁珠上。核酸分子的分子量越大，越傾向于發(fā)生這種從伸展線團(tuán)向蜷縮小球的構(gòu)象變化，因此，通過(guò)調(diào)節(jié)鹽溶液與核酸樣本的體積比，能夠?qū)崿F(xiàn)較大分子量的核酸片段在羧基磁珠表面的優(yōu)先吸附，達(dá)到所謂的片段篩選效應(yīng)。

（圖4：MS050羧基磁珠用于片段篩選，說(shuō)明：納微MS050羧基磁珠以DNA ladder為樣本，可以實(shí)現(xiàn)尺寸在100 – 1500 bp之間的左側(cè)篩選（去除小片段）和右側(cè)篩選（去除大片段））

3.氨基/咪唑基等正電荷磁珠

此類磁珠能夠方便地通過(guò)調(diào)節(jié)pH實(shí)現(xiàn)核酸分子在表面的可逆結(jié)合。不過(guò)，由于正電荷表面對(duì)核酸分子吸附過(guò)強(qiáng)，容易導(dǎo)致收率偏低，因此正電荷磁珠的使用反而不如硅羥基及羧基磁珠廣泛。

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