認識基于微流控技術(shù)的數(shù)字PCR
聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù),它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制,PCR的最大特點是能將微量的DNA大幅增加。1983年美國Mullis首先提出聚合酶鏈式反應(yīng)設(shè)想,1985年由其發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng),即簡易DNA擴增法,意味著PCR技術(shù)的真正誕生。
PCR是利用DNA在體外攝氏95°高溫時變性會變成單鏈,低溫(經(jīng)常是60°C左右)時引物與單鏈按堿基互補配對的原則結(jié)合,再調(diào)溫度至DNA聚合酶最適反應(yīng)溫度(72°C左右),DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈?;诰酆厦钢圃斓腜CR儀實際就是一個溫控設(shè)備,能在變性溫度,復(fù)性溫度,延伸溫度之間很好地進行控制。
數(shù)字PCR即Digital PCR(dPCR),它是一種核酸分子絕對定量技術(shù)。相較于傳統(tǒng)的PCR,數(shù)字PCR可讓你能夠直接數(shù)出DNA分子的個數(shù),是對起始樣品的絕對定量。
20 世紀末,Vogelstein 等提出數(shù)字PCR( digitalPCR,dPCR) 的概念,通過將一個樣本分成幾十到幾萬份,分配到不同的反應(yīng)單元,每個單元至多包含一個拷貝的目標分子( DNA 模板) ,在每個反應(yīng)單元中分別對目標分子進行PCR 擴增,擴增結(jié)束后對各個反應(yīng)單元的熒光信號進行統(tǒng)計學(xué)分析。
數(shù)字PCR是一種核酸分子絕對定量技術(shù)。當前核酸分子的定量有三種方法:光度法基于核酸分子的吸光度來定量;實時熒光定量PCR(Real Time PCR)基于Ct值,Ct值就是指可以檢測到熒光值對應(yīng)的循環(huán)數(shù);數(shù)字PCR是最新的定量技術(shù),基于單分子PCR方法來進行計數(shù)的核酸定量,是一種絕對定量的方法。主要采用當前分析化學(xué)熱門研究領(lǐng)域的微流控或微滴化方法,將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應(yīng)器或微滴中,每個反應(yīng)器的核酸模板數(shù)少于或者等于1個。這樣經(jīng)過PCR循環(huán)之后,有一個核酸分子模板的反應(yīng)器就會給出熒光信號,沒有模板的反應(yīng)器就沒有熒光信號。根據(jù)相對比例和反應(yīng)器的體積,就可以推算出原始溶液的核酸濃度。
標簽:   微流控 數(shù)字PCR 微反應(yīng)器 微液滴