自1985年Kary Mullis發(fā)明PCR技術(shù)以來(lái)，PCR及時(shí)一直生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中重要的實(shí)驗(yàn)方法。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，熒光定量PCR是目前的主要核酸定量方法。數(shù)字PCR(digital PCR, dPCR)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的新技術(shù)，由于其不需要建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以對(duì)核酸的拷貝數(shù)進(jìn)行絕對(duì)定量，因此具有更廣泛的應(yīng)用前景。

數(shù)字PCR技術(shù)的原理

數(shù)字PCR(digital PCR, dPCR)的原理并不復(fù)雜，dPCR是一種對(duì)含有核酸分子的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系進(jìn)行有限稀釋，使稀釋后的每個(gè)反應(yīng)含或不含一個(gè)或者多個(gè)拷貝的待檢靶分子（DNA模板），實(shí)現(xiàn)每個(gè)反應(yīng)為一個(gè)獨(dú)立的PCR反應(yīng)器，經(jīng)PCR擴(kuò)增后對(duì)每個(gè)獨(dú)立反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)，并以終點(diǎn)信號(hào)的有或無(wú)作為判斷標(biāo)準(zhǔn)（有熒光信號(hào)的微滴判讀為“1”，無(wú)熒光信號(hào)的微滴判讀為“0”）。最后，根據(jù)泊松分布原理及陽(yáng)性反應(yīng)器的比例，利用分析軟件計(jì)算待檢靶分子的濃度或拷貝數(shù)，從而獲得最終結(jié)果。

dPCR的特點(diǎn)是靈敏高、定量精確、檢測(cè)的線性范圍寬、特異性好、費(fèi)用適中，是一種很有前途的分子定量檢測(cè)手段。dPCR與傳統(tǒng)PCR、定量PCR相比，定量結(jié)果不再依賴于Ct 值，直接給出靶序列的起始濃度，實(shí)現(xiàn)真正意義上的絕對(duì)定量，因此這項(xiàng)技術(shù)在極微量核酸樣本檢測(cè)、復(fù)雜背景下稀有突變檢測(cè)和表達(dá)量微小差異鑒定方面的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)已被普遍認(rèn)可，而其在基因表達(dá)研究、microRNA研究、基因組拷貝數(shù)鑒定、癌癥標(biāo)志物稀有突變檢測(cè)、致病微生物鑒定、轉(zhuǎn)基因成分鑒定、NGS測(cè)序文庫(kù)精確定量和結(jié)果驗(yàn)證等諸多方面具有的廣闊應(yīng)用前景已經(jīng)受到越來(lái)越多的關(guān)注。

dPCR基本原理（微滴式）

數(shù)字PCR可以直接計(jì)算目標(biāo)序列的拷貝數(shù)，因此無(wú)需依賴于對(duì)照樣品和標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以進(jìn)行精確的絕對(duì)定量檢測(cè)；此外，由于數(shù)字PCR在進(jìn)行結(jié)果判讀時(shí)僅判斷有/無(wú)兩種擴(kuò)增狀態(tài)，因此也不需要檢測(cè)熒光信號(hào)與設(shè)定閾值線的交點(diǎn)，完全不依賴于Ct值的鑒定，因此數(shù)字PCR的反應(yīng)受擴(kuò)增效率的影響大大降低，對(duì)PCR反應(yīng)抑制物的耐受能力大大提高；數(shù)字PCR實(shí)驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系分配的過(guò)程可以極大程度上降低與目標(biāo)序列有競(jìng)爭(zhēng)性作用的背景序列濃度，因此數(shù)字PCR技術(shù)也特別適合在復(fù)雜背景中檢測(cè)稀有突變。

數(shù)字PCR的產(chǎn)生和發(fā)展

20 世紀(jì)末，Vogelstein 等在檢測(cè)糞便中進(jìn)行癌變組織脫離細(xì)胞的BRAF特異突變型基因時(shí)，因受到體細(xì)胞基因的干擾，而碰到檢測(cè)靈敏度和檢測(cè)分辨率的瓶頸，而采用了在384孔板中對(duì)每個(gè)反應(yīng)孔的樣品量進(jìn)行極限稀釋并增加反應(yīng)孔數(shù)進(jìn)行檢測(cè)的方式，從而提出了數(shù)字式PCR的概念，同時(shí)也提出如果采用更多孔板其檢測(cè)靈敏度會(huì)更高，從而指出了數(shù)字PCR系統(tǒng)的發(fā)展方向。

雖然dPCR技術(shù)的原理并不復(fù)雜，然而早期在第一步的樣品稀釋的環(huán)節(jié)上卻遇到了相當(dāng)大的困難，在稀釋的數(shù)量和均勻性上都很難達(dá)到要求，這一困難極大地限制了dPCR技術(shù)的發(fā)展。直到近幾年，dPCR技術(shù)終于突破了技術(shù)瓶頸，實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化產(chǎn)品，目前主流核酸樣品稀釋分散技術(shù)主要包括基于微孔板，油包水微滴，微流控芯片等。

基于微孔芯片的數(shù)字 PCR 檢測(cè)

數(shù)字PCR技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域

1. 稀有變異檢測(cè)

從外周血內(nèi)獲得分子生物標(biāo)記物、進(jìn)行特異突變篩查、監(jiān)測(cè)病程是醫(yī)療保健的一個(gè)發(fā)展方向。這要求檢測(cè)體系(探針和引物)必須保證能在高背景野生型等位基因存在的條件下檢測(cè)到低豐度的突變基因。由于數(shù)字PCR降低了對(duì)反應(yīng)擴(kuò)增效率的要求，采取終點(diǎn)法判讀的方法，數(shù)字PCR可以很好的勝任稀有變異檢測(cè)的工作，同時(shí)也減少了引物設(shè)計(jì)過(guò)程中由于擴(kuò)增效率不合要求而造成的浪費(fèi)(時(shí)間、樣品、耗材等等)。 

2. 拷貝數(shù)變異

雖然生殖系或體細(xì)胞拷貝數(shù)變化是否具有臨床意義需要取決于具體臨床情況，但CNV改變基因表達(dá)水平卻有十分重要的臨床意義。數(shù)字PCR具有準(zhǔn)確性和精確性的特點(diǎn)，這使得其可以在CNV研究中發(fā)揮重要的作用。在有已知拷貝數(shù)的內(nèi)參基因的前提下，數(shù)字PCR不但可以清晰區(qū)分一個(gè)或者兩個(gè)拷貝，更可以對(duì)多拷貝基因進(jìn)行分析，例如，五個(gè)或者六個(gè)拷貝。在這一點(diǎn)上，相比于包括qPCR在內(nèi)的常規(guī)方法，數(shù)字PCR優(yōu)勢(shì)明顯。 

3. 樣本需求量低

數(shù)字PCR的一個(gè)主要優(yōu)勢(shì)是所需樣本量很低，這對(duì)于一些臨床樣本來(lái)說(shuō)特別重要，尤其是樣本珍貴或者樣本核酸存在降解的情況下。目前很多基因組研究方法，例如CGH芯片、二代測(cè)序等，在實(shí)驗(yàn)之前都需要對(duì)有限的臨床樣本進(jìn)行擴(kuò)增以保證達(dá)到實(shí)驗(yàn)樣本量的要求。然而，實(shí)際情況是，預(yù)擴(kuò)增會(huì)引入偏向，無(wú)法保證不改變樣本內(nèi)待測(cè)基因的相對(duì)豐度，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響的嚴(yán)重程度取決于不同的應(yīng)用。 數(shù)字PCR樣本需求量低的特性可以避免由于預(yù)擴(kuò)增所引入的實(shí)驗(yàn)誤差，更好的實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)的精準(zhǔn)性和可靠性。 

4. 分析便捷

數(shù)字PCR有或無(wú)的結(jié)果判讀非常簡(jiǎn)潔。對(duì)于相對(duì)定量分析來(lái)說(shuō)，只需使用泊松原理將陰性/陽(yáng)性微滴的比例轉(zhuǎn)換成表達(dá)豐度、使用一個(gè)或多個(gè)內(nèi)參基因進(jìn)行均一化后即可完成分析。  

5. 與二代測(cè)序整合

如何在臨床領(lǐng)域發(fā)揮NGS的巨大優(yōu)勢(shì)是一個(gè)重要的問(wèn)題。數(shù)字PCR是一項(xiàng)非常有用的互補(bǔ)型技術(shù)。例如：使用數(shù)字PCR檢測(cè)患者特異性標(biāo)記物，與腫瘤配對(duì)末端測(cè)序?qū)嶒?yàn)結(jié)果進(jìn)行相互驗(yàn)證，并且可以進(jìn)行NGS文庫(kù)的制備和定量。 

數(shù)字PCR為分子生物學(xué)、微生物學(xué)、液體活檢等領(lǐng)域提供了新的檢測(cè)方法和實(shí)驗(yàn)思路。從應(yīng)用范圍和實(shí)驗(yàn)成本角度來(lái)看，數(shù)字PCR不可能完全取代熒光定量PCR，但從重復(fù)性、準(zhǔn)確性和樣本量方面可以給PCR技術(shù)帶來(lái)重要的補(bǔ)充。

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